[發明專利]一種無血清的脂肪間充質干細胞的培養基及細胞培養方法

有效

• 申請號: 202010530455.X
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111808803B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 楊桂花;趙進軍;趙宇飛
• 申請（專利權）人: 和攜科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 趙萬凱

本發明公開了一種無血清的脂肪間充質干細胞的培養基及細胞培養方法，屬于細胞培養的技術領域，解決了傳統培養基中的血清的引用帶來的微生物污染、實驗結果穩定性差的問題。培養基中的血清替代物的添加量為3.5~4.5%，包括以下組分：人血清蛋白、轉鐵蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、維生素B₂、輔酶A、維生素B₁₂、血管內皮生長因子、血管內皮生長因子2型受體、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、促紅細胞生成素、胰島素樣生長因子、胰島素、重組人生長激素、蛋白酶抑制劑、L?谷氨酰胺、轉化生長因子、白細胞介素21、造血細胞生長因子等。本發明的培養基具有無微生物污染、實驗過程穩定的優點。

技術領域

本發明涉及細胞培養的技術領域，更具體地說，它涉及一種無血清的脂肪間充質干細胞的培養基及細胞培養方法。

背景技術

間充質干細胞是一種多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在臨床應用也最多，與造血干細胞聯合應用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。間充質干細胞來源于多種組織：如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等。

2001年，研究者首次從人體脂肪組織的提取物中分離出具有多向分化潛能的細胞，將其命名為脂肪組織提取細胞(processde lipoaspirate cells，PLA細胞)，后稱之為脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)。ADMSCs具有自我更新及多向分化潛能，同時具有橫向的跨胚層分化能力。由于ADMSCs不僅具有來源廣泛、取材容易等特點，而且不涉及倫理道德問題，因此可以作為組織工程的種子細胞。目前ADMSCs的研究已經成為近年來干細胞研究的熱點之一。很多研究也已經證實ADMSCs具有向心肌細胞、脂肪細胞、神經細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等多譜系分化的潛能。這些研究結果對心肌、骨、軟骨、神經等方面的再生具有重要意義。

目前對于脂肪來源的間充質干細胞的培養所采用的傳統培養基是基礎培養基加以胎牛血清后混合而成的，授權公告號為CN 101314766 B的發明專利公開了一種分離培養人脂肪間充質干細胞的方法及其專用培養基，該人脂肪間充質干細胞的分離培養用培養基，包括動物細胞基礎培養基、胎牛血清、表皮生長因子和血小板衍生生長因子，其中胎牛血清的終濃度為1-200mL/L。授權公告號為CN 103857789 B的發明專利公開了一種制備間充質干細胞基礎培養基和利用間充質干細胞基礎培養基制備細胞治療產品的方法及用該培養基得到的分化產品，其中L，間充質干細胞基礎培養基包括選自胎牛、馬或人的血清中的一種，且胎牛血清的添加量為10-20％。授權公告號為CN 104263697 B的發明專利公開了一種誘導培養基及誘導人脂肪間充質干細胞生成胰島素分泌細胞的方法，其中該誘導培養基包括溶劑DMEM-高糖培養基和10％胎牛血清。

但是，雖然胎牛血清富含細胞體外培養所需要的生長因子，同時卻也存在以下的不足：胎牛血清的具體成分不確定，不適合重復性實驗；具有微生物污染(病毒，細菌，內毒素等)；倫理問題(胎牛的不正常死亡可獲取胎牛血清)。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明的第一個目的在于提供一種無血清的脂肪間充質干細胞的培養基，其具有使得細胞培養過程安全無污染且培養得到的脂肪間充質干細胞純度高，質量好的優點。

本發明的第二個目的在于提供一種利用無血清的脂肪間充質干細胞的培養基的細胞培養方法。

為實現上述第一個目的，本發明提供了如下技術方案：一種無血清的脂肪間充質干細胞的培養基，所述培養基包括基礎培養基和血清替代物，所述血清替代物的添加量為基礎培養基質量的3.5～4.5％，所述血清替代物包括以下組分，各組分的終濃度分別為：