[發(fā)明專利]一種高比活力堿性磷酸酶工程菌、工程菌構(gòu)建及堿性磷酸酶純化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010530428.2
• 申請(qǐng)日: 2020-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111662917A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高玉舟;李海超;何欣;喬善鵬;劉珍妮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濟(jì)南國(guó)科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/55
• 分類號(hào): C12N15/55;C12N1/21;C12N9/16;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發(fā)明公開(kāi)了一種高比活力堿性磷酸酶工程菌、工程菌構(gòu)建及堿性磷酸酶純化方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)對(duì)Cobetia marina的堿性磷酸酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，利用優(yōu)化后的堿性磷酸酶基因構(gòu)建工程菌，該工程菌的保藏編號(hào)為CGMCC NO.18926。用本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程菌表達(dá)，其發(fā)酵量可達(dá)10mg(1L發(fā)酵液)。本發(fā)明還對(duì)蛋白的純化方法進(jìn)行了創(chuàng)新，用本發(fā)明中的提純方法，可以得到最終純度大于95％的酶蛋白，比活力可達(dá)12000U/mg，相對(duì)現(xiàn)有國(guó)際上常見(jiàn)的堿性磷酸酶，是一種活力極高的堿性磷酸酶，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化鋪墊，也為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)堿性磷酸酶提供了有效地方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高比活力堿性磷酸酶工程菌、工程菌構(gòu) 建及堿性磷酸酶純化方法。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(Apase；EC 3.1.3.1)在堿性條件下催化磷酸鹽化合物水解，該酶被廣泛應(yīng) 用于免疫標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光。此外，堿性磷酸酶在DNA和蛋白質(zhì)免疫分析中也有廣泛應(yīng)用。 酶的比活力高低直接影響到免疫分析以及化學(xué)發(fā)光的靈敏度，因此大量獲得高比活力的堿 性磷酸酶顯得尤為重要。

自然界中絕大多數(shù)生物體細(xì)胞內(nèi)都含有堿性磷酸酶，從微生物細(xì)胞到人體細(xì)胞。大腸 桿菌堿性磷酸酶是目前研究最為透徹的堿性磷酸酶，該酶為同源二聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基由 449個(gè)氨基酸組成，商品化大腸桿菌堿性磷酸酶的比活力為40-100U/mg，其比活力相對(duì)較 低。比活力最高的商品化堿性磷酸酶來(lái)源于牛小腸，最高可達(dá)7000U/mg左右。

來(lái)源于一種深海菌Cobetia marina的堿性磷酸酶，命名為CmAP，其比活力可達(dá)15000U/mg，遠(yuǎn)大于牛小腸堿性磷酸酶。詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)：A Highly Active AlkalinePhosphatase from the Marine Bacterium Cobetia,E.Yu Plisova etc.,MarineBiotecnology,Volume 7, 173–178(2005)。但是，Cobetia marina在工業(yè)上很難大規(guī)模培養(yǎng)，而且該菌株的堿性磷酸 酶產(chǎn)量很低。通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建工程菌雖然可以外源表達(dá)堿性磷酸酶，但CmAP 的N端有一段由32個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，該信號(hào)肽對(duì)蛋白質(zhì)折疊成正確構(gòu)象起著必不 可少的作用，蛋白折疊成有活性的構(gòu)象后，該信號(hào)肽即被自動(dòng)切除，因此該酶不適合在N 末端加親和標(biāo)簽；而在肽鏈的C末端加親和標(biāo)簽會(huì)嚴(yán)重影響酶的表達(dá)與活力，這導(dǎo)致外源 表達(dá)的CmAP很難進(jìn)行純化。

因此，如何提高CmAP的表達(dá)量以及如何獲得高純度的CmAP是目前亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種高比活力堿性磷酸酶工程菌，以及利用 該工程菌表達(dá)純化堿性磷酸酶CmAP的方法。本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌，其堿性磷酸酶的發(fā) 酵量比野生菌株Cobetia marina有大幅度的提高，更加適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求；本發(fā)明還對(duì) 蛋白純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終得到純度不亞于用親和標(biāo)簽純化的蛋白。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種編碼堿性磷酸酶CmAP的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本發(fā)明以源于海科貝特氏菌Cobetia marina的堿性磷酸酶基因?yàn)槟０澹M(jìn)行針對(duì)大腸 桿菌表達(dá)體系的密碼子優(yōu)化，使優(yōu)化后的編碼堿性磷酸酶CmAP的基因更適合于大腸桿菌 的表達(dá)系統(tǒng)。

本發(fā)明的第二方面，提供上述基因在構(gòu)建堿性磷酸酶工程菌中的應(yīng)用。