[發明專利]一種高比活力堿性磷酸酶工程菌、工程菌構建及堿性磷酸酶純化方法

在審

• 申請號: 202010530428.2
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111662917A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 高玉舟;李海超;何欣;喬善鵬;劉珍妮
• 申請（專利權）人: 濟南國科醫工科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N1/21;C12N9/16;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種編碼堿性磷酸酶CmAP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.權利要求1所述的基因在構建堿性磷酸酶工程菌中的應用。

3.一種堿性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP，其生物保藏號為：CGMCC NO.18926。

4.權利要求3所述的堿性磷酸酶工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以海科貝特氏菌Cobetia marina的堿性磷酸酶基因CmAP為模板，對CmAP基因進行適合大腸桿菌表達體系的密碼子優化，優化后的CmAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將步驟(1)優化后的CmAP基因酶切后與pET16b表達載體連接，得到重組表達載體pET16b-CmAP；

(3)將重組表達載體pET16b-CmAP轉化到大腸桿菌表達宿主Escherichia coli BL21(DE3)中，構建得到堿性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP；

優選的，所述重組表達載體pET16b-CmAP是將堿性磷酸酶基因CmAP插入到表達載體pET16b的NdeⅠ和BamHⅠ位點間得到。

5.權利要求3所述的堿性磷酸酶工程菌在生產高比活力堿性磷酸酶中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所生產的高比活力堿性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一種高比活力堿性磷酸酶的表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

將權利要求3所述的堿性磷酸酶工程菌的種子液接種至含有氨芐青霉素的發酵培養基中，接菌量為2‰～5‰，發酵培養，得到工程菌發酵液；

將工程菌發酵液離心，收集菌體，進行細胞超聲破碎，再經40％和70％硫酸銨分級分離、Phenyl HP疏水層析、2次High Q陰離子交換層析，得到純化的高比活力堿性磷酸酶CmAP。

8.根據權利要求7所述的表達純化方法，其特征在于，所述含有氨芐青霉素的發酵培養基的組成為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100μg/mL；培養基的pH值為7.0～7.2；

優選的，所述發酵培養的條件為：37℃、180r/min振蕩培養至OD₆₀₀＝0.6-0.8時加入終濃度0.5mM IPTG進行誘導，同時將溫度調整為16℃，誘導發酵18～24h。