[發明專利]抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的shRNA及制備方法、引物與應用

在審

• 申請號: 202010529603.6
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111647602A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 陳偉釗;莫亦琳;鐘路遙;王曉彥;莫蓓莘
• 申請（專利權）人: 深圳大學;深圳大學龍華生物產業創新研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/11;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙) 44268
• 代理人: 劉芙蓉

本發明公開抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的shRNA及制備方法、引物與應用。其中抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA，依次包括靶序列、環形結構序列、靶序列的互補序列；其中所述靶序列為GGAGUUCGAUGCCGUUAAGGA。本發明提供的抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA能穩定、高效、顯著和特異性抑制薇甘菊中編碼光捕獲蛋白基因的mRNA表達。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及特異性靶向抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA及制備方法、引物與應用。

背景技術

黃曲條跳甲在全球范圍內廣泛存在，并且是廣東地區的頭號蔬菜害蟲。目前對黃曲條跳甲還沒有有效的防治方法，噴化學殺蟲劑仍然是生產上主要的防治手段，但是化學農藥的長期大量使用，不僅造成生態環境污染、影響食品安全，還導致害蟲抗藥性逐漸增強。因此，研制綠色防控技術非常迫切。

RNA干擾(RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。在抗蟲研究中，噴在昆蟲取食的農作物上的雙鏈RNA(dsRNA)或短發卡結構RNA(shRNA)，隨昆蟲攝食進入中腸，被中腸細胞吞食，在Dicer作用下加工成siRNA而啟動RNAi信號通路，引發重要基因沉默。如果目標mRNA在昆蟲體內編碼的是一個基本功能性蛋白，其表達受阻將導致昆蟲死亡。RNAi抗蟲技術有特異性強、效率高、操作簡便、不易產生抗性及對環境友好等優點。RNAi具有很強的特異性，它只降解同源序列的mRNA，對其他序列的表達沒有影響。因此可以針對特定害蟲設計非常專一性的dsRNA或shRNA而不會影響其他有益昆蟲，也不會危害其他動植物和人類健康。鑒于上述的眾多優點，RNAi技術已成為研究基因功能及新型殺蟲技術的新工具。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供特異性靶向抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA及制備方法、引物與應用。

本發明的技術方案如下：

抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA，其中，所述干擾性shRNA依次包括靶序列、環形結構序列、靶序列的互補序列；

其中所述靶序列為GGAGUUCGAUGCCGUUAAGGA。

進一步地，所述干擾性shRNA的序列結構如下所示：

一種本發明所述的抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA的制備方法，其中，包括步驟：

根據靶基因的序列，設計出干擾性shRNA序列；

根據干擾性shRNA序列，設計一對引物序列；

利用所設計的一對引物，通過填充反應生成制備shRNA轉錄模板；

利用制備好的shRNA轉錄模板，通過體外轉錄的方式，制備得到干擾性shRNA。

一種用于制備本發明所述的抑制黃曲條跳甲精氨酸激酶蛋白表達的干擾性shRNA的引物，其中，所述引物序列為：

上游引物序列P1：

5’TAATACGACTCACTATAGGAGTTCGATGCCGTTAAGGACTTGCTTC3’；(含T7啟動子序列TAATACGACTCACTATA、靶標序列GGAGTTCGATGCCGTTAAGGA、環形結構序列CTTGCTTC)

下游引物序列P2：

5’AAGGAGTTCGATGCCGTTAAGGA GAAGCAAG3’。(含人為添加的2個A、靶標序列GGAGTTCGATGCCGTTAAGGA、環形結構序列的互補序列GAAGCAAG)