[發(fā)明專利]一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法

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• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111635917A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設計）人: 王杰;顏祥飛;彭文靜;李卓;王姝昕;宋輝;馮曉燕
• 申請（專利權）人: 遼寧天華生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12N1/20;C12N9/12;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 馬維駿

本發(fā)明涉及生物酶催化制備領域，具體涉及一種β?煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法。該方法首先通過高密度發(fā)酵法制備煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶，然后煙酰胺核糖和ATP在煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶作用下生產(chǎn)β?煙酰胺核糖二核苷酸。本發(fā)明提供制備煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶的高密度發(fā)酵方法，方法中使用發(fā)酵培養(yǎng)基中含有適合大腸桿菌生長的必需元素，在誘導劑IPTG的作用下，使得大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中良好生長并且能夠高產(chǎn)煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶，酶活比較高。本發(fā)明提供β?煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法效率高，操作簡單，收率高，使用的煙酰胺核糖和ATP是常見的原料，成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

技術領域

本發(fā)明涉及生物酶催化制備領域，具體涉及一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法。

背景技術

在目前所有發(fā)現(xiàn)的酶中，約有30-35%為氧化還原酶。在工業(yè)生物技術，特別是生物藥物和精細化工行業(yè)中，氧化還原酶是重要的酶類。在氧化還原酶所催化的反應中，生成產(chǎn)物的同時接需要消耗一定的輔酶以進行電子和質(zhì)子的轉移。據(jù)統(tǒng)計約80%的反應需要以煙酰胺核糖二核苷酸即氧化型輔酶I（簡稱NAD +）作為輔酶，NAD +中與腺嘌呤相連的核糖環(huán)系2'-位的磷酸化衍生物是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，又名氧化型輔酶II，(NADP + )是一種重要的輔酶。氧化型輔酶II通過氧化還原反應的形式傳遞質(zhì)子、電子及能量，并且參與到細胞很多代謝反應中，脂類、脂肪酸和核苷酸的合成，能活化多酶系統(tǒng)，促進核酸、蛋白質(zhì)、多糖的合成及代謝，提高物質(zhì)轉運和調(diào)節(jié)控制，改善代謝功能。研究表明，氧化型輔酶II能促進物質(zhì)代謝、能量代謝、抵抗細胞衰老和抗氧化作用。

NAD+在生物中廣泛存在，但含量極低，從生物中提取的NAD+每公斤市場價格在數(shù)萬元。工業(yè)化生產(chǎn)中使用NAD+ ，但其生產(chǎn)方法較少。目前NAD+的化學法和生物酶法。化學法以煙酰胺核糖為原料，同樣會用到昂貴試劑和易爆試劑，成本高還會發(fā)生事故。生物酶催化因為其固有的高效率、綠色環(huán)保等優(yōu)點逐漸成為工業(yè)制備煙酰胺核糖二核苷酸(NAD+)的主流方法，但現(xiàn)有的生物酶法操作復雜，并且收率不高。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術關于β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法存在操作復雜且收率不高的問題，本發(fā)明的目的是提供一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案。

一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，具體包括以下步驟。

步驟一、將大腸桿菌接種到LB的固體培養(yǎng)基在37℃的條件下培養(yǎng)12～18h，得到含有大腸桿菌的固體斜面。

步驟二、將含有大腸桿菌的斜面接種量接入經(jīng)過滅菌的種子液中，在溫度為37℃，搖床轉速為180～200r/min的條件下，培養(yǎng)至OD600為3.2時，搖瓶種子液長好。

步驟三、通過高密度發(fā)酵法制備煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶，發(fā)酵培養(yǎng)基是由以下質(zhì)量百分比的原料組成：蛋白胨1.0-2.0%、酵母浸粉0.2-1.0%、磷酸二氫鉀0.05-0.15%、磷酸氫二鉀0.03-0.10%、甘油0.5-1.0%、硫酸鎂0.05-0.2%、消泡劑0.05-0.10%、其余是飲用水；培養(yǎng)基使用蒸汽滅菌后，分別接種含有煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶基因的大腸桿菌，溫度33-37℃，通氣量3-10L/min，攪拌是300-600rpm，在發(fā)酵罐里培養(yǎng)5-6小時加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG 0.5g誘導，繼續(xù)培養(yǎng)15～22小時，得到培養(yǎng)液。

步驟四、分別把步驟三中兩種培養(yǎng)液經(jīng)過離心取菌體，使用0.2-0.6MPa壓力勻漿破碎后過濾取濾液，把濾液使用中空膜過濾濃縮得到酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶的酶濃縮液。