[發明專利]一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法

在審

• 申請號: 202010529554.6
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111635917A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 王杰;顏祥飛;彭文靜;李卓;王姝昕;宋輝;馮曉燕
• 申請（專利權）人: 遼寧天華生物藥業有限公司
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12N1/20;C12N9/12;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 馬維駿

1.一種β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

步驟一、將大腸桿菌接種到LB的固體培養基在37℃的條件下培養12～18h，得到含有大腸桿菌的固體斜面；

步驟二、將含有大腸桿菌的斜面接種量接入經過滅菌的種子液中，在溫度為37℃，搖床轉速為180～200r/min的條件下，培養至OD600為3.2時，搖瓶種子液長好；

步驟三、通過高密度發酵法制備煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶，發酵培養基是由以下質量百分比的原料組成：蛋白胨1.0-2.0%，酵母浸粉0.2-1.0%，磷酸二氫鉀0.05-0.15%，磷酸氫二鉀0.03-0.10%，甘油0.5-1.0%，硫酸鎂0.05-0.2%，消泡劑0.05-0.10%，其余是飲用水；培養基使用蒸汽滅菌后，分別接種含有煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶基因的大腸桿菌，溫度33-37℃，通氣量3-10L/min，攪拌是300-600rpm，在發酵罐里培養5-6小時加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG 0.5g誘導，繼續培養15～22小時，得到培養液；

步驟四、分別把步驟三中兩種培養液經過離心取菌體，使用0.2-0.6MPa壓力勻漿破碎后過濾取濾液，把濾液使用中空膜過濾濃縮得到酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶的酶濃縮液；

步驟五、把煙酰胺核糖34g、ATP 100g和8-16g氯化鎂溶解到2L純化水里，分別加入步驟四中煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶的酶濃縮液20-80g，溫度控制在30-37℃，過程使用氫氧化鈉溶液控制pH6.40-6.60之間，檢測煙酰胺核糖的殘留和生成的β-煙酰胺核糖二核苷酸，在酶的作用下在4小時之內煙酰胺核糖殘留在0.02g/L以下，生成的β-煙酰胺核糖二核苷酸達到濃度最高。

2.如權利要求1所述的β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，步驟三中的發酵培養基是由以下質量百分比的原料組成：蛋白胨1.0-1.5%，酵母浸粉0.5-0.8%，磷酸二氫鉀0.05-0.10%，磷酸氫二鉀0.05-0.08%，甘油0.5-0.8%，硫酸鎂0.10-0.15%，消泡劑0.05-0.08%，其余為水。

3.如權利要求1所述的β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，步驟五中加入氯化鎂的量是10-15g。

4.如權利要求1所述的β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，步驟五中加入煙酰胺核糖激酶和煙酰胺單核苷酸轉移酶的酶濃縮液30-60g。

5.如權利要求1所述的β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，步驟五中溫度控制為35-37℃。

6.如權利要求1所述的β-煙酰胺核糖二核苷酸的制備方法，其特征在于，步驟五中pH控制在6.45-6.55。