[發(fā)明專利]檢測AML預(yù)后相關(guān)基因突變的引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010529086.2
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111560438A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 辛秋紅;王潔;吳建成;張亞飛
• 申請（專利權(quán)）人: 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了檢測AML預(yù)后相關(guān)基因突變的引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用，所述引物組合物包括檢測FLT3?ITD突變、FLT3?TKD突變、NPM1突變和CEBPA突變的共6組引物對，各對引物相互配合，實現(xiàn)了對AML預(yù)后相關(guān)突變基因的全面檢測，操作簡單方便，靈敏度高、準確性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及檢測AML預(yù)后相關(guān)基因突變的引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一組以造血干細胞增殖失控、分化受阻、同時抑制正常造血功能為特點的異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性疾病，包括多種具有不同遺傳異常和臨床特征的實體。AML患者的5年以上長期生存率不足50％，即使預(yù)后良好的患者也極易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后預(yù)后極差。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因突變是影響AML預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。

WHO2008髓系腫瘤與急性白血病分類指南推薦對所有正常核型急性髓系白血病(CN-AML)患者進行NPM1、FLT3和CEBPA基因篩查；WHO2016分類指南將伴有NPM1基因突變的AML和伴有CEBPA基因突變的AML單獨歸為一類，納入伴重現(xiàn)性基因突變的AML當(dāng)中；2010年歐洲國際專家組公開的AML診治方案認為臨床工作應(yīng)該進行NPM1、CEBPA和FLT3突變檢測；成人急性髓系白血病(非APL)中國診療指南(2017年版)將FLT3-ITD、NPM1、CEBPA等基因突變列為分子學(xué)檢測對象中的初級檢查指標，作為急性髓系白血病(AML)分型和危險度分組的基礎(chǔ)。

fms樣酪氨酸激酶3(fms-like tyrosinekinase3，F(xiàn)LT3)基因突變是AML最常見的基因突變之一，主要包括FLT3跨膜區(qū)的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變(FLT3-ITD)和累及活化環(huán)中的點突變(FLT3-TKD)兩種形式。伴有FLT3-ITD陽性的患者表現(xiàn)為較低的CR率、DFS、EFS和OS，具有獨立的不良預(yù)后意義。

NPM1是一種廣泛在核仁表達的磷蛋白質(zhì)，定位于人類染色體5q35，含有12個外顯子，編碼由294個氨基酸組成的NPM蛋白。它可以在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭，參與核糖體蛋白的組裝和運輸，調(diào)控中心體的復(fù)制以及腫瘤抑制因子ARF的表達。NPM1突變會導(dǎo)致蛋白從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，引起急性髓細胞白血病。NPM1基因突變是目前AML最常見的突變形式，NPM1突變在急性髓系白血病中通常被認為是預(yù)后良好的因素之一。

CCAAT增強子結(jié)合蛋白A(CEBPA)基因位于染色體19q13.1，全長3318bp，序列中無內(nèi)含子。CEBPA是維持造血系統(tǒng)粒系分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細胞增殖與分化中發(fā)揮著十分重要的作用。作為轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一的髓系轉(zhuǎn)錄因子，CEBPA是髓系祖細胞增殖與分化過程中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，在誘導(dǎo)粒系分化和抑制細胞增殖方面具有重要作用，其功能的破壞、喪失常與AML的發(fā)生有關(guān)，恢復(fù)CEBPA表達可以作為誘導(dǎo)分化治療手段。

目前，同時檢測FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA的技術(shù)主要有NGS技術(shù)、PCR+毛細管電泳技術(shù)、q-PCR技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，但或多或少存在一些缺點：NGS技術(shù)檢測周期長、花費高；PCR+毛細管電泳技術(shù)主要采用Sanger測序技術(shù)和片段分析技術(shù)，Sanger測序技術(shù)需要對每個位點單獨操作，流程復(fù)雜，人力物力消耗大，片段分析技術(shù)也是對每個基因單獨進行PCR擴增，單獨上機或者混合上機，目前成熟的產(chǎn)品一般只包括1-2個基因，覆蓋不全面；q-PCR技術(shù)通量小，不適用于多基因檢測；焦磷酸測序技術(shù)操作過程復(fù)雜，通量小；瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對短片段插入?yún)^(qū)分不明顯，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

目前國內(nèi)外檢測FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA主要以DNA和RNA為操作對象，F(xiàn)LT3-ITD以RNA為操作對象會造成檢測范圍不全面，因為ITD突變包括內(nèi)含子的插入。另外，RNA極易被污染和降解，逆轉(zhuǎn)錄效率低，影響檢測靈敏度。

因此，有必要構(gòu)建一種新的FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA檢測技術(shù)。