[發(fā)明專利]一種DNA可逆保護(hù)和分離的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010528082.2
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111690718B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹博;張清華;劉莉莉;季紅
• 申請（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳泛航知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

本發(fā)明提供了一種對DNA進(jìn)行可逆保護(hù)和分離的方法，首先將目標(biāo)DNA分子的5’端進(jìn)行磷酸化；然后將5’端腺苷化修飾；終止反應(yīng)后獲得的樣品中加入對腺苷化修飾DNA敏感的核酸外切酶消化模板；最后將獲得的腺苷化修飾DNA，即分離所得目標(biāo)DNA，進(jìn)行測序鑒定等技術(shù)分析，所得序列的5’端即為腺苷化修飾位點。本發(fā)明提供的方法，填補了現(xiàn)有技術(shù)無法精確定位基因組DNA上斷裂位點的空白，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同長度和不同來源的DNA樣品進(jìn)行斷裂位點的定量和定位分析，使用簡便，易于操作，而且對樣品無特殊要求，準(zhǔn)確率高、檢測背景影響低、分辨率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于對DNA大分子進(jìn)行可逆保護(hù)和分離的方法。

背景技術(shù)

DNA分子存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA的完整性對細(xì)胞至關(guān)重要。然而，多種外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都會導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，如紫外線、輻射、致癌性化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞自身代謝過程中產(chǎn)生的氧化壓力等。這些損傷破壞了基因組的完整性，并威脅著基因組的穩(wěn)定。現(xiàn)在普遍認(rèn)為DNA損傷是癌癥和許多其他與衰老相關(guān)疾病的主要原因，因此對人類健康來說這是一個非常重要的問題。

在諸多DNA損傷類型中，鏈斷裂（Strand?break）是公認(rèn)的對細(xì)胞危害最大的一種損傷，因為鏈斷裂可以阻斷DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，同時還可能導(dǎo)致重組事件發(fā)生。因此，DNA鏈斷裂是生命科學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。其中，研究基因組DNA上鏈斷裂發(fā)生的位置和規(guī)律是理解該類損傷的基礎(chǔ)。

目前，在全基因組范圍內(nèi)定位DNA斷裂位點的技術(shù)主要有兩種： Baranello課題組開發(fā)的DSB-Seq、SSB-Seq技術(shù)和 Philipp?Kapranov課題組的SSiNGLe技術(shù)。前者使用生物素和地高辛分別標(biāo)記雙鏈斷裂位點和單鏈斷裂位點，然后親和富集標(biāo)記的DNA片段并結(jié)合二代測序進(jìn)行分析。SSiNGLe技術(shù)在DNA片段化過程中，利用微球菌核酸酶（MNase）消化DNA產(chǎn)生3’磷酸末端，然后通過末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）添加PolyA尾來對具有3’羥基末端的DNA斷裂位點進(jìn)行標(biāo)記捕獲，并與二代測序相結(jié)合。這兩種方法雖然實現(xiàn)了全基因組范圍內(nèi)對DNA斷裂位點的定位，但是它們在應(yīng)用過程中均存在局限性。例如，DSB-和SSB-seq對斷裂位點定位的分辨率較低，測序過程中背景高等；而SSiNGLe技術(shù)無法檢測發(fā)生在DNA腺嘌呤（Adenine，A）上的斷裂。

因此，鑒于DNA斷裂的重要性和目前鑒定技術(shù)的局限性，本發(fā)明開發(fā)了一種通過對目標(biāo)DNA分子進(jìn)行可逆保護(hù)和分離的方式，實現(xiàn)了低成本、高靈敏度、高分辨率定位DNA斷裂位點，并且進(jìn)一步應(yīng)用于定位DNA多種類型的損傷和修飾的研究。該技術(shù)將極大推動DNA損傷－修復(fù)過程、癌癥發(fā)生機(jī)理及預(yù)防、藥物安全性評估、基因治療、遺傳疾病等領(lǐng)域的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有檢測DNA損傷方法背景高、分辨率低、準(zhǔn)確率低的問題，本發(fā)明提供一種可用于檢測DNA損傷的DNA可逆保護(hù)和分離的方法，能夠高精度定位DNA損傷位點，可以應(yīng)用于不同長度和不同來源的DNA樣品，可以對目標(biāo)DNA進(jìn)行單分子、單核苷水平的分離和分析。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種DNA可逆保護(hù)和分離的方法，包括以下步驟：

（1）將DNA分子通過酶處理，獲得含5’磷酸化DNA的樣品；

（2）將含5’磷酸化DNA的樣品解旋獲得單鏈DNA；

（3）將單鏈DNA進(jìn)行5’腺苷化標(biāo)記，獲得含5’腺苷化DNA的樣品；

（4）使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶對步驟（3）獲得的樣品進(jìn)行消化，去除未被5’腺苷化修飾的單鏈DNA，純化后獲得腺苷化修飾的目標(biāo)DNA分子；