[發(fā)明專利]一種DNA可逆保護(hù)和分離的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010528082.2
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111690718B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹博;張清華;劉莉莉;季紅
• 申請（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳泛航知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

1.一種DNA可逆保護(hù)和分離的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將DNA分子通過酶處理，獲得含5’磷酸化DNA的樣品；

(2)將含5’磷酸化DNA的樣品解旋獲得單鏈DNA；

(3)將單鏈DNA進(jìn)行5’腺苷化標(biāo)記，獲得含5’腺苷化DNA的樣品；

(4)使用腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶對步驟(3)獲得的樣品進(jìn)行消化，去除未被5’腺苷化修飾的單鏈DNA，純化后獲得腺苷化修飾的目標(biāo)DNA分子；

(5)對腺苷化修飾的目標(biāo)DNA分子進(jìn)行去腺苷化處理，即可獲得目標(biāo)DNA分子；

步驟(1)中，所述酶為能夠?qū)⒑?’羥基的DNA轉(zhuǎn)化為5’磷酸化DNA的酶；所述酶選自T4多聚核苷酸激酶；

步驟(3)中，所述5’腺苷化標(biāo)記為通過酶修飾DNA的5’末端；所述酶選自T4?DNALigase；

步驟(4)中，所述腺苷化敏感的5’→3’核酸外切酶選自T5核酸外切酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述DNA分子為雙鏈或單鏈；所述DNA分子為單鏈時(shí)，省略步驟(2)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述解旋過程為熱變性。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)(3)(5)分別還包括對反應(yīng)后樣品的純化處理過程。

5.一種采用如權(quán)利要求1-4任一所述的方法檢測DNA分子損傷和修飾位點(diǎn)的非診斷目的的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(i)提取DNA分子、破碎、去磷酸化，獲得樣品；

(ii)按照上述方法獲得目標(biāo)DNA分子；

(iii)對目標(biāo)DNA分子進(jìn)行測序并分析比對，即可獲得損傷或修飾位點(diǎn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(i)中，所述破碎的步驟為超聲破碎。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述破碎的大小為200-500bp。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(iii)中，所述測序選自Sanger測序或Illumina測序。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(iii)中，測序?yàn)镮llumina測序時(shí)還包括以下步驟：將去目標(biāo)DNA分子轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA后，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用于Illumina測序。