[發(fā)明專利]一種熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的引物探針組及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010525553.4
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111500790A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王印;陳婉婷;張鵬飛;姜睿姣;朱光恒;涂藤;羅燕;楊澤曉;姚學(xué)萍
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

本發(fā)明公開了一種熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的引物探針組及其應(yīng)用，所述的引物為MGF360?F和MGF360?R，所述的探針為MGF360?Taq Man，所述的MGF360?F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的MGF360?R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的MGF360?Taq Man的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并提供了該引物探針組用于檢測非洲豬瘟的方法和試劑盒。本發(fā)明引物探針組具有高靈敏性和特異性，彌補現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，為我國生豬產(chǎn)業(yè)的復(fù)興奠定堅實的技術(shù)儲備與理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的引物探針組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟是家豬和野豬的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，強毒株可在感染的約5-14天內(nèi)殺死家豬，其中死亡率接近100％，無有效預(yù)防疫苗，無特效治療藥物。2018年8月3日，我國遼寧省沈陽市沈北新區(qū)報告了第一例非洲豬瘟疫情，非洲豬瘟疫情的發(fā)生給我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的危害。為防止非洲豬瘟的快速傳播，早診斷早處理，是現(xiàn)階段防控非洲豬瘟的主要辦法。

PCR檢測方法是OIE官方推薦的檢測方法，該方法對病原核酸純度要求較低、操作簡便快速、敏感性和特異性高，尤其適用于鑒定體外分離不到病原。

實時熒光定量PCR(qPCR)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。2019年1月4日，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了第一批ASFV現(xiàn)場快速檢測試劑，其中60％以上都是運用實時qPCR檢測方法。該方法能實時檢測反應(yīng)過程，測定模板的絕對量，特異性強等優(yōu)點使得qPCR在實際排查ASFV上，有更高的利用價值。

TaqMan探針法是具有高度特異性的定量qPCR技術(shù)。它的工作原理是在PCR反應(yīng)體系中存在一對PCR引物和一條探針，探針的5′端標(biāo)記有報告基團，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。當(dāng)探針完整的時候，報告基團的熒光能量被淬滅基團吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應(yīng)的進展，Taq酶遇到探針，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探針切斷，導(dǎo)致報告基團的熒光能量不能被淬滅基團吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

本申請應(yīng)用TaqMan探針法檢測，根據(jù)ASFV的保守基因片段設(shè)計引物能夠特異性地鑒定ASFV。與OIE推薦的熒光定量PCR相比，OIE主要基于ASFV早期診斷靶標(biāo)B646L(p72)基因設(shè)計，本申請主要針對非洲豬瘟病毒MFG360基因進行檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種非洲豬瘟熒光定量PCR檢測引物、探針及其方法，對非洲豬瘟病毒MGF360基因進行實時熒光定量PCR進行檢測。彌補現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，為我國生豬產(chǎn)業(yè)的復(fù)興奠定堅實的技術(shù)儲備與理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)；

一種熒光定量PCR檢測非洲豬瘟的引物探針組，所述的引物為MGF360-F和MGF360-R，所述的探針為MGF360-Taq Man，所述的MGF360-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的MGF360-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的MGF360-Taq Man的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

所述的探針5′端標(biāo)記有報告基團，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團，所述的報告基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQ1。

在本發(fā)明的另一方面，提供了序列如SEQ ID NO.1～2所示引物或序列如SEQ IDNO.3所示探針在檢測非洲豬瘟中的應(yīng)用。