[發明專利]基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組和試劑盒

在審

• 申請號: 202010524432.8
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111635953A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 童桂香;韋信賢;林勇;譚紅連;陳秀荔;熊建華;黃光華;楊慧贊;王瑞
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水產科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了基于TaqMan?MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組和試劑盒，屬于病毒檢測技術領域。具體包括檢測蝦肝腸胞蟲(EHP)的引物和TaqMan?MGB探針，以及基于上述檢測引物和探針的試劑盒、檢測方法。本發明設計特異性的引物及TaqMan?MGB探針，制備了重組質粒標準品pMD18?T?SSU^EHP，建立檢測EHP的TaqMan?MGB探針熒光定量PCR方法，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量范圍寬及簡單快速等優點，適用于蝦類樣品的EHP定量檢測，可為EHP快速定量檢測及實時監測提供一種新的技術手段。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，更具體地說是涉及基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組和試劑盒。

背景技術

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)屬于腸胞蟲科、腸胞蟲屬的一種專性細胞內寄生的微孢子蟲，在2004年最早發現于泰國養殖的斑節對蝦并于2009年首次被分離和正式命名報道，主要感染凡納濱對蝦和斑節對蝦等重要養殖蝦類，是近10年危害養殖對蝦的主要病原之一。EHP可通過水平和垂直傳播，但主要經口攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或水體中的孢子體而感染。EHP感染主要導致養殖對蝦生長緩慢甚至停滯，表現為對蝦消瘦、大小不均、重量離散；還可導致患病蝦肝胰腺遭到破壞，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡，給對蝦養殖業造成了嚴重損失。

研究發現，EHP感染數量與其危害密切相關，輕度感染基本上不影響對蝦的生長發育，中度感染影響對蝦營養吸收，嚴重感染損壞對蝦免疫系統；但輕度感染蝦會逐漸發展到重度感染。因此，建立一種快速、準確的EHP定量檢測方法，在蝦苗檢疫、親蝦篩選及成蝦養殖疫情監測中可根據EHP定量數據結合蝦的大小和養殖模式制定相應的措施，對防控由EHP引起的蝦病害具有重要的意義。

EHP感染前期無明顯病癥，需采用組織學方法或分子生物學方法等實驗室手段檢測才能確診。EHP檢測方法包括原位雜交、套式PCR、熒光定量PCR和環介導等溫擴增(LAMP)等，但是這些方法在靈敏度和便捷程度上各有優缺點；特別是在EHP定量檢測方面，目前采用的TaqMan探針定量PCR由于探針長度太長，敏感性不夠理想。

目前國內尚未發布EHP檢測的相關標準，而農業農村部在蝦肝腸胞蟲病(EHPD)監測計劃中仍推薦采用套式PCR法進行檢測。但在實際檢測工作中，套式PCR法存在操作繁瑣、檢測時間長、不能定量等缺點，不能滿足對EHP進行快速定量檢測的需求。

因此，建立一種基于TaqMan-MGB探針的EHP熒光定量PCR檢測方法，以提高EHP定量檢測的靈敏度及效率是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組和試劑盒。

熒光定量PCR相比普通PCR，其檢測和分析過程在密閉的單管里由機器自動完成，具自動化程度高、有效解決PCR產物污染問題、能定量檢測病原體感染的強弱等優點，在實驗室檢測病原體的方法選擇上被認為是最理想的方法；TaqMan-MGB探針則是熒光定量PCR使用的一種熒光探針，其3′端的淬滅基團為不發光的MGB(Minor Groove Binder)結合物，可實現高Tm值的探針長度縮短易于與模板退火而利于提高方法的靈敏度，且探針3′端不發光的淬滅基團與5′端報告基團在空間的位置更接近，使熒光本底降低、實驗結果分辨率更高。

本發明的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR法既能發揮熒光定量PCR法的優勢而克服套式PCR法的缺點，且其探針連接MGB基團相對于TaqMan探針因長度縮短易于與模板退火而更有利于提高方法的靈敏度，非常適用于對靈敏度要求高的病原體定量檢測，可提高EHP檢測的敏感性和效率。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：