[發明專利]基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組和試劑盒

在審

• 申請號: 202010524432.8
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111635953A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 童桂香;韋信賢;林勇;譚紅連;陳秀荔;熊建華;黃光華;楊慧贊;王瑞
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水產科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種基于TaqMan-MGB探針的蝦肝腸胞蟲熒光定量PCR檢測引物組，其特征在于，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探針EHP-qP66，序列如下：

EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；

EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；

EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；

其中，EHP-qP66的5′端標記熒光染料FAM、3′端標記MGB基團。

2.一種基于權利要求1所述引物組的檢測試劑盒，其特征在于，包括反應液、工作標準品、陽性對照和陰性對照。

3.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應液包括2×Probe qPCRPremix Ex Taq^TM、ROX Reference DyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探針EHP-qP66和滅菌ddH₂O。

4.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應液共2.3mL；每劑反應液為45μL，包含2×Probe qPCR Premix Ex Taq^TM25μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0μL，10μmol/L TaqMan-MGB探針EHP-qP66 3.0μL，滅菌ddH₂O 10.5μL。

5.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述工作標準品為pMD18-T-SSU^EHP，濃度為1.0×10⁴～1.0×10⁸拷貝/μL，各200μL。

6.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述工作標準品pMD18-T-SSU^EHP的制備方法為：PCR擴增EHP DNA，經瓊脂糖凝膠回收純化后與pMD18-T連接，轉化DH5α，得到重組質粒pMD18-T-SSU^EHP，并進行PCR及測序鑒定。

7.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為1.0×10⁵拷貝/μL的pMD18-T-SSU^EHP，所述陰性對照為不含EHP DNA的蝦組織DNA溶液，各200μL。

8.權利要求1所述的引物組在制備檢測蝦肝腸胞蟲的試劑盒中的應用，其特征在于，采用50μL反應體系，即45μL反應液加入5μL待檢模板；待檢樣品與工作標準品、陽性對照、陰性對照、空白對照同時進行檢測；熒光定量PCR反應條件：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火并延伸35s，擴增40個循環；在60℃結束時收集熒光信號；質量控制：建立標準曲線，其相關系數方值(RSq)應≥0.980；陰性對照和空白對照的Ct值應不顯示，陽性對照的EHP DNA拷貝量應為1×10⁴～1×10⁶拷貝/μL，否則檢測視為無效。