[發明專利]作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p的應用及其檢測方法

在審

• 申請號: 202010523816.8
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111534584A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 季煜華;周心;季秋虹;季菊玲
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/113
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

1.一種作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p，其特征在于，所述血清外泌體miR-410-3p的序列為：AATATAACACAGATGGCCTGT。

2.一種作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p的應用，其特征在于，用于急性腦梗死診斷和治療的生物標志物。

3.一種作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）收集血清；

（2）分離血清中的外泌體，通過Illumina對血清中的外泌體進行small RNA測序，從中獲得miRNAs表達譜，進行生物信息學分析篩選樣品間差異表達miRNAs；

（3）實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術分析腦組織特異性的miR-410-3p在腦卒中患者和健康人群血清外泌體中的表達。

4.根據權利要求3所述的作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p的檢測方法，其特征在于，步驟（2）的具體步驟為：

（2-1）外泌體RNA的抽提取；

（2-1-1）將保存于-80℃的血清220-260μl在冰上融化，21000g、4℃離心15 min；

（2-1-2）將上清轉移至新的EP管中，加入1/4體積的ExoQuick溶液輕輕顛倒混勻，4℃孵育30 min，13500g離心5min，去除上清，保留沉淀備用；

（2-1-3）加PBS 重懸外泌體沉淀，加入3倍TRIZOL LS 試劑抽提RNA，每管樣品加入100fmol miRNA 標準品Cel- mir-39，最后提取的RNA沉淀用RNA Free H₂O 溶解；

（2-2）小RNAs文庫的構建和上機測序

（2-2-1）樣品檢測合格后，用Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina試劑盒進行外泌體小RNAs文庫構建；

（2-2-2）分別在外泌體總RNAs 3'端和5'端連接上接頭，反轉錄合成cDNA；

（2-2-3）PCR富集后，采用膠分離技術篩選目的片段，從8%PAGE凝膠中切膠回收140bp的條帶，并使用Agilent Bioanalyzer 2100芯片評估文庫質量及長度；

（2-2-4）庫檢合格后，采用 illumine Hiseq 2500 測序平臺的單端 125 bp 測序模式對樣本進行高通量測序；

（2-3）測序數據分析

（2-3-1）Illumina HiSeq2500 平臺測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別轉化為原始測序序列，結果以FASTQ文件格式存儲；將raw data 去除含有接頭，含 ploy-N和低質量的Reads，以及長度過濾，最終得到Clean reads；所有的下游分析都基于高質量的cleandata；利用Bowtie軟件，將Clean Reads分別與Silva數據庫、 GtRNAdb數據庫、Rfam數據庫和Repbase 數據庫進行序列比對，過濾核糖體 RNA、轉運RNAs、核內小RNAs、核仁小RNAs等ncRNAs以及重復序列，獲得包含miRNAs的Unannotated reads；最后，利用miRDeep2軟件進行已知miRNAs鑒定和新miRNAs預測；

（2-3-2）比較腦卒中患者和健康人群血清外泌體中之間miRNAs 的表達，以尋找差異表達的miRNAs：將兩組樣本miRNAs的表達歸一化，即把miR-39 的reads數用10000來歸一化；當某個miRNA的歸一化表達為零時，將其表達值修改為0.01；在miRNA reads數歸一化之后，用歸一化后的數據計算log2 倍數變化和P值；當miRNAs的p值≤0.05，|log2fold-change|≥1 時，miRNAs被定為差異表達。

5.根據權利要求3所述的作為急性腦梗死診斷標志物的血清外泌體miR-410-3p的檢測方法，其特征在于，步驟（3）為外泌體RNA抽提及實時定量PCR，具體步驟為：

（3-1）采用trizol法抽提血清外泌體的總RNA：使用超微量紫外分光光度計對RNAs進行定量和純度測定；采用基于poly-A加尾法的miDETECT A Track? miRNA qRT-PCR試劑盒和CFX 96 PCR儀檢測miR-410-3p；

（3-2）研究血清外泌體中miR-410-3p的表達：采用Q-PCR檢測血清外泌體中miR-410-3p，用加入的Cel- mir-39作為外參，2^-ΔΔCT表示目的基因的相對表達水平。