[發明專利]一種地特胰島素的制備方法

在審

• 申請號: 202010523777.1
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN113773395A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 唐亞連;劉慧玲;楊接運
• 申請（專利權）人: 寧波鯤鵬生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/62;C12N15/70;C12P21/06;C07K1/06;C07K1/20;A61K38/28;A61P3/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;徐迅

本發明提供了一種地特胰島素衍生物及其制備方法。具體地，本發明的方法利用包含綠色熒光蛋白折疊單元的地特胰島素融合蛋白進行地特胰島素的制備，并對Boc修飾的地特胰島素主鏈進行Fmoc修飾，利用正交保護進行地特胰島素的側鏈加成。本發明還提供該制備方法過程中涉及的Fmoc和Boc修飾的地特胰島素主鏈以及包含地特胰島素主鏈的融合蛋白。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種地特胰島素的制備方法。

背景技術

糖尿病是全球范圍內威脅人類健康的一大疾病。在中國，隨著人民生活方式的改變和老齡化進程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趨勢。糖尿病的急慢性并發癥，尤其是慢性并發癥累計多個器官，致殘、致死率高，嚴重影響患者的身心健康，并給個人、家庭和社會帶來沉重的負擔。

胰島素及其類似物是最直接和最有效的糖尿病治療藥物，中國胰島素市場潛力巨大。地特胰島素(Insulin detemir)是一種中性、可溶的長效胰島素。它是原型胰島素去除了B鏈第30位蘇氨酸，通過酰化作用在B29位賴氨酸側鏈ε-氨基結合一個14碳的直鏈脂肪酸而成，是一種胰島素類似物。酰化的脂肪酸可穩定胰島素分子的自身聚集，且與白蛋白可逆性結合，使地特胰島素從皮下注射部位吸收緩慢，作用持續時間延長，在控制血糖的同時能減少低血糖的風險。

由于胰島素原、胰島素或胰島素類似物都具有位于A1、B1位置氨基酸的游離α-氨基與B29位賴氨酸側鏈上的游離ε-氨基，這三種游離氨基均可與活性酯、酰鹵或酸酐形成共價鍵，從而形成單酰化胰島素、雙酰化胰島素甚至三酰化產物。從諾和諾德申請的多項專利中公開的酰化路線，首先利用二碳酸二叔丁酯(BOC)衍生保護胰島素兩條鏈的N末端α-氨基，再利用肉豆蔻酸琥珀酰亞胺酯酰化B29位賴氨酸的ε-氨基，最后利用TFA脫保護，生成地特胰島素。如果酰化劑過量會生成大量的二取代或者三取代衍生物，因此該工藝步驟繁瑣、副產物多，會增加下游純化的難度，同時不利于整體收率的提高。ε-氨基選擇性酰化專利(中國專利CN1171742A)中采用一步選擇性酰化，在pH 10.5的堿性條件下，利用優選活化酯(棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)進行酰化反應，酸性條件終止反應，該方法雖然在一定程度上提升了酰化效率，其最終的酰化效率仍然不高，距規模化的工業應用尚有一定的距離，有待改進。

現有由胰島素前體通過酰化反應制備地特胰島素或其類似物的方法中不同程度的存在酰化效率低、副產物多、成本高等缺點。因此，開發一種新的可產業化的酰化效率高、副產物少，生產成本低的地特胰島素或其類似物的高效制備方法，將為工業化應用奠定重要的基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種地特胰島素的制備方法。

在本發明的第一方面，提供了一種地特胰島素前體融合蛋白，從N端到C端具有式III所示的結構：

A-FP-TEV-R-G(III)

式中，

“-”代表肽鍵；

A為無或前導肽，

FP為綠色熒光蛋白折疊單元，

TEV為第一酶切位點，較佳地為TEV酶酶切位點；

R為用于酶切的精氨酸或賴氨酸；

G為地特胰島素主鏈或其活性片段；

其中，所述的綠色熒光蛋白折疊單元包含2-6個選自下組的β-折疊單元：