[發明專利]一種能夠高效捕獲冷凍生物樣本染色體三維構象的高通量測序建庫技術

有效

• 申請號: 202010522547.3
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111733214B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 李付廣;鄭武;葛曉陽;王曄;楊召恩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.一種適用于Hi-C高通量測序建庫的樣本前處理方法，包括如下步驟：將供試生物樣本先冷凍再交聯固定；

所述冷凍為零下196℃低溫處理；

在所述冷凍和所述交聯固定之間還包括將所述供試生物樣本進行預冷凍交聯和梯度升溫的過程；

所述預冷凍交聯是在預冷凍交聯液中進行的，所述預冷凍交聯液為含有2%水、0.01%甲醛的酒精溶液，%表示體積百分含量；

所述梯度升溫為-90℃ 6h、-60℃ 6 h、-30℃ 6 h、0℃ 6 h；

在所述梯度升溫的過程中，從-90℃升至-60℃是每小時升溫5℃，從-60℃升至-30℃是每小時升溫5℃，從-30℃升至0℃是每小時升溫5℃。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述冷凍為將所述供試生物樣本置于液氮中進行速凍。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述交聯固定為利用甲醛溶液進行交聯固定。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括將所述供試生物樣本依次進行如下處理的步驟：

（A1）液氮速凍研磨；

（A2）預冷凍交聯；

（A3）梯度升溫；

（A4）離心，加NIbuffer過濾；

（A5）甲醛交聯固定；

（A6）甘氨酸終止交聯；

（A7）離心回收細胞核；

所述NIbuffer的配方如下：20 mM Hepes pH 8，250 mM蔗糖，1 mM氯化鎂，5 mM氯化鉀，體積百分含量40%的甘油，體積百分含量0.25%的Triton X-100，0.1 mM PMSF，體積百分含量0.1%的β-巰基乙醇，1/5體積分數的cocktail。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：在步驟（A1）中，將所述供試生物樣本放入液氮進行速凍，并在液氮中研磨成粉末。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：在步驟（A2）中，將（A1）研磨的粉末轉移到-90℃的所述預冷凍交聯液中。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：在步驟（A4）中，進行所述離心后去除上清，加預冷的所述NIbuffer懸浮沉淀，用Miracloth過濾，收集濾液，離心。

8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述甲醛溶液為體積百分含量為37%的甲醛溶液。

9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：在步驟（A5）中，向（A4）離心所得上清液中加入體積百分含量為37%的甲醛水溶液進行交聯固定，交聯的溫度為室溫，時間為8min。

10.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：進行所述交聯固定時，所述甲醛在體系中的終濃度為1%體積百分含量。

11.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（A6）中，過加入濃度為2.5M的甘氨酸溶液終止交聯。

12.一種Hi-C高通量測序建庫方法，包括如下步驟：先利用權利要求1-11中任一所述方法對供試生物樣本進行預處理；然后將處理后的樣本進行Hi-C高通量測序建庫。

13.一種Hi-C高通量測序方法，包括如下步驟：先利用權利要求1-11中任一所述方法對供試生物樣本進行預處理；接著將處理后的樣本進行Hi-C高通量測序建庫；最后進行Hi-C高通量測序。

14.根據權利要求1或12或13所述的方法，其特征在于：所述生物樣本為細胞或組織。

15.根據權利要求1或12或13所述的方法，其特征在于：所述生物為植物或動物。