[發明專利]一種能夠高效捕獲冷凍生物樣本染色體三維構象的高通量測序建庫技術

有效

• 申請號: 202010522547.3
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111733214B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 李付廣;鄭武;葛曉陽;王曄;楊召恩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

本發明公開了一種能夠高效捕獲冷凍生物樣本染色體三維構象的高通量測序建庫技術。本發明提供了適用于Hi?C高通量測序建庫的樣本前處理方法，包括：將供試生物樣本先冷凍，再梯度升溫，后交聯固定。本發明FS?Hi?C技術不僅適用于新鮮樣品，也適用于冷凍樣品。本發明結果顯示冷凍替換樣品和新鮮樣品的染色質三維結構高度相似，Hi?C文庫質量提高。與傳統Hi?C前處理方法相比，FS?Hi?C在染色質互作、A/B compartment和TAD等方面高度一致，且FS?Hi?C法構建文庫質量更好，庫容增加，有效互作數據更多，PCR擴增產生的重復數據降低。該技術降低了對樣本時效性的要求。本發明為Hi?C在生物中的應用提供了一種改進的方法。

技術領域

本發明涉及染色體構象捕獲的技術領域，特別涉及一種能夠高效捕獲冷凍生物樣本染色體三維構象的高通量測序建庫技術。

背景技術

染色體是一種存在于細胞核內的特殊結構，根據“結構決定功能”原則，染色體三維(3D) 結構自然成為理解其生物學功能的基礎，基因組的3D結構對DNA的復制、損傷修復及轉錄調控起著至關重要的作用。通過探索染色質間的遠程調控作用，可以鑒定得到調控元件的未知靶基因，研究順式調控元件調控的基因、eQTL調控的表型、TAD重組及A/Bcompartment 轉換調控的基因表達，然而限于技術上的原因，對染色體3D結構解析的進展一直較為緩慢。

2002年，Dekker等建立了3C染色體構象捕獲(chromosome conformationcapture,3C)技術，這是一種研究染色體和蛋白互作的染色體構象技術，可以分析直線距離很遠的基因位點之間的關聯性。3C技術解決的是直線距離較遠的2個DNA片段的空間關系，即“一對一”關系。該項技術對于染色體DNA空間結構領域的研究具有里程碑的意義，開創了染色質三維高級結構研究的新紀元，并啟發了一系列衍生技術的問世。2006年出現的4C和5C技術，分別是解決DNA片段“一對多”和“多對多”的關系。盡管這些衍生技術深化了對染色體片段之間相互關系的理解，但是仍然無法從整體上認識染色體3D結構。

近年來，隨著日益成熟的高通量測序技術的發展，大規模基因組信息的獲得變得更加容易。2009年，Dekker等將染色體構象捕獲和日益成熟的高通量測序技術結合，首次建立了最高通量的Hi-C(highest-throughput chromosome conformation capture)技術。Hi-C是一種分析染色體空間構象的高通量測序技術，它能夠在全基因組范圍內捕捉不同基因座位之間的空間交互，有助于研究者理解染色體三維空間結構、染色體之間相互作用以及基因表達的空間調控機制。Hi-C技術是在3C技術的基礎上進行了修改，添加了生物素標記的核苷酸，使得后續剪切產生的小片段DNA能夠富集，并對這些片段的兩端添加測序接頭，進而采用最新的測序手段對結果進行比對分析。該技術步驟多、耗時長，涉及的試劑耗材繁雜，整個流程還有較多可以改進優化的空間。現有Hi-C高通量測序的這些缺陷限制了該技術在促進功能基因組研究中的應用，因此有必要對該技術進行改進，從而提供一種高效、便捷、經濟和適用性廣的新的Hi-C高通量測序建庫方法。染色體互作在基因組結構和基因調控中起著重要作用， Hi-C是研究物種三維基因組結構的有力工具。然而，獲取天然染色質構象需要新鮮的樣本，這阻礙了三維基因組研究的進展。

水的固態有三種形態，包括兩種晶型(六方晶型和立方晶型)和玻璃態。玻璃態是由于樣品的快速凍結而來不及形成晶體而產生的。晶體的形成導致水凍結時膨脹，但玻璃態水在凝固后不會膨脹，這使得玻璃態水成為生物標本唯一理想的凍結形式。基于上述原理，液氮(LN2) 被廣泛應用于生物樣品的冷凍和長期保存。然而，冷凍標本很少用于三維基因組研究。人們普遍認為從液氮溶液中移出后樣品在升溫過程中會對三維基因組結構產生影響。冷凍替換(FS) 技術通常被用來維持單細胞和多細胞動植物的結構，因此它被廣泛地應用于制備常規光學顯微鏡、透射電鏡和掃描電鏡的樣品。

發明內容