[發(fā)明專利]嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010522048.4
• 申請(qǐng)日: 2020-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN111635914A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李梅;李茵茵;陳銳鑾;周銳濤;陳雄兒;張適陽(yáng);李丹;許承佳;劉貽堯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 電子科技大學(xué)中山學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 合肥市科融知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34126
• 代理人: 林娣

1.一種嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒，其特征在于，所述敲除質(zhì)粒為在帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒中插入有嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂以及sgRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒，其特征在于，所述同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：

根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因，設(shè)計(jì)sgRNA；

將所述sgRNA與帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒連接，得到靶向重組質(zhì)粒；

以嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂為模板進(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，得同源重組修復(fù)模板；

將所述靶向重組質(zhì)粒與所述同源重組修復(fù)模板連接，即得敲除質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因，設(shè)計(jì)sgRNA的步驟，包括：

根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因以及sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，設(shè)計(jì)引物sgRNA-F/R，所述sgRNA-F的序列如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA-R的序列如SEQ ID NO:4所示；

將所述sgRNA-F/R進(jìn)行稀釋處理，退火連接sgRNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述將所述sgRNA與帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒連接的步驟，包括：

將所述sgRNA與BsaⅠ酶切后的帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒連接，連接體系為：退火后的sgRNA片段0.4~0.6pmol，2×T4 DNA Ligase Buffer 10μL，酶切后的帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒20~80ng，T4 DNA Ligase 1μL，加ddH₂O至20μL，16~22℃連接3~16h。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述將所述sgRNA與帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒連接，得靶向重組質(zhì)粒的步驟之后，還包括：

將靶向重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增引物為3×FLAG-F/T7-Term-R，所述3×FLAG-F的序列如SEQ ID NO:5所示，所述T7-Term-R的序列如SEQ ID NO:6所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述以嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂為模板進(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，得同源重組修復(fù)模板的步驟，包括：

分別以aerA-UF/UR和aerA-DF/DR為引物，從嗜水氣單胞菌基因組擴(kuò)增上、下同源臂，所述aerA-UF的序列如SEQ ID NO:7所示，所述aerA-UR的序列如SEQ ID NO:8所示，所述aerA-DF的序列如SEQ ID NO:9所示，所述aerA-DR的序列如SEQ ID NO:10所示；

以所述上、下同源臂為模板進(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，得到同源重組修復(fù)模板。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述將所述靶向重組質(zhì)粒與所述同源重組修復(fù)模板連接的步驟，包括：

回收純化XbaⅠ酶切后的靶向重組質(zhì)粒，與所述同源重組修復(fù)模板連接，反應(yīng)體系為：5×CEⅡBuffer 4μL，靶向重組質(zhì)粒160~200ng，同源重組修復(fù)模板 45~60ng，ExnaseⅡ 2μL，加ddH₂O至20μL，37℃反應(yīng)0.5h。