[發(fā)明專利]嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010522048.4
• 申請日: 2020-06-10
• 公開（公告）號: CN111635914A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李梅;李茵茵;陳銳鑾;周銳濤;陳雄兒;張適陽;李丹;許承佳;劉貽堯
• 申請（專利權(quán)）人: 電子科技大學(xué)中山學(xué)院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 合肥市科融知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34126
• 代理人: 林娣

本發(fā)明適用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，其中，所述嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒為在帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒中插入有嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂以及sgRNA。本發(fā)明通過在帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在特定的位點(diǎn)裝入aerA基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂（XbaⅠ位點(diǎn)插入）和sgRNA，作為同源重組修復(fù)模板和靶向序列，達(dá)到定點(diǎn)敲除基因的目標(biāo)，一方面，實現(xiàn)了具有對目標(biāo)生物基因組的定點(diǎn)編輯功能的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的方法；另一方面，所得到的嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒，可應(yīng)用于靶向敲除嗜水氣單胞菌氣溶素基因，為制備嗜水氣單胞菌新型弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)隸屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬，是一種食源性致病菌，同時也是人-獸-水生動物共患病病原菌。作為一種普遍存在的條件致病菌，嗜水氣單胞菌可分泌氣溶素、溶血素等外毒素，感染多種水生動物導(dǎo)致急性出血性敗血癥等，使水產(chǎn)養(yǎng)殖損失巨大，嚴(yán)重影響該行業(yè)的發(fā)展。近年來，有研究表明，嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的毒力因子與細(xì)菌的致病力密切相關(guān)。氣溶素是嗜水氣單胞菌極其重要的毒力因子之一，由aerA基因表達(dá)翻譯，具有種屬特異性，可作為致病性菌株的標(biāo)志。氣溶素具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性，低濃度下即可裂解細(xì)胞。氣溶素前體蛋白經(jīng)切割C末端肽段之后可形成成熟的氣溶素蛋白，它與真核細(xì)胞膜表面特異性受體結(jié)合，聚合后插入到靶細(xì)胞膜中，形成眾多細(xì)胞膜通道，使胞內(nèi)滲透壓上升，引起細(xì)胞裂解。

近年來，在大部分古細(xì)菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR，實際上是一種基因編輯器，是細(xì)菌用來對抗病毒DNA的免疫系統(tǒng)。CRISPR協(xié)同Cas蛋白發(fā)揮免疫抑制作用，能抵御噬菌體及質(zhì)粒等外源遺傳物質(zhì)的入侵。在此之前，最為常用的基因編輯工具酶為鋅指核酸酶(ZFN)及轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)。ZFN脫靶效應(yīng)較高，TALEN也有其局限性，主要表現(xiàn)在蛋白較大，遞送比較困難；這兩種技術(shù)在構(gòu)建質(zhì)粒時難度較大，后期操作技術(shù)要求高，因此在普通實驗室難以實現(xiàn)。傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)多利用同源重組的方法，然而其敲除率低，費(fèi)時費(fèi)力。與傳統(tǒng)同源交換技術(shù)相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)的敲除效率高，操作方便快捷，因此在細(xì)菌基因組的編輯中大受歡迎。至今為止，尚未見利用CRISPR的cas9基因構(gòu)建靶向嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實施例的目的在于提供一種嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒。

本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒，所述敲除質(zhì)粒為在帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒中插入有嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂以及sgRNA。

本發(fā)明實施例的另一目的在于一種嗜水氣單胞菌氣溶素基因的敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

根據(jù)嗜水氣單胞菌氣溶素基因，設(shè)計sgRNA；

將所述sgRNA與帶有CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒連接，得靶向重組質(zhì)粒；

以嗜水氣單胞菌氣溶素基因敲除序列同源但缺失部分堿基序列的同源臂為模板進(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，得同源重組修復(fù)模板；

將所述靶向重組質(zhì)粒與所述同源重組修復(fù)模板連接，即得。