[發明專利]大熊貓輪狀病毒CH-1株VP7陽性質粒及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010519089.8
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111635910A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 蘇小艷;侯蓉;劉頌蕊;張東升;燕霞;李林;李運莉;岳嬋娟
• 申請（專利權）人: 成都大熊貓繁育研究基地
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/46;C12N1/21;C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/19
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 袁克來

本發明公開了一種大熊貓輪狀病毒CH?1株VP7陽性質粒及其構建方法和應用；涉及大熊貓輪狀病毒檢測技術領域，所述VP7陽性質粒由所述VP7基因和PUC57載體構建而成；本發明通過將上述VP7陽性質粒轉化到感受態細胞中，再經細胞培養、提取質粒，能夠無限得到VP7陽性質粒，可實現在基層單位以及不能進行大熊貓輪狀病毒CH?1株病毒培養的單位進行大熊貓輪狀病毒的PCR檢測。

技術領域

本發明涉及大熊貓輪狀病毒檢測技術領域，具體涉及一種大熊貓輪狀病毒CH-1株VP7陽性質粒及其構建方法和應用。

背景技術

輪狀病毒是引起嬰幼兒和各種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原之一；王成東等于2009年首次從大熊貓腹瀉糞便中檢測并分離出輪狀病毒，將其命名為大熊貓輪狀病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1毒株。GPRV CH-1株主要感染5～11月齡的斷奶大熊貓，感染后通常表現為體溫升高、嘔吐、水瀉、蛋花樣腹瀉、腹瀉物中含有血、白細胞總數和中性粒細胞增多、淋巴細胞減少、腹水、頑固性胃腸脹氣、腹瀉遷延不愈甚至死亡等癥狀，通過常規對癥治療能較大縮短該病的治療療程、治愈率達100％，且很少出現并發癥，但目前尚無有效疫苗和特效藥物對GPRV感染進行防治，這對大熊貓的健康造成了嚴重威脅。

GPRV CH-1株在大熊貓糞便中含量較高，可通過提取大熊貓糞便的總RNA進行分子生物學診斷，即常規RT-PCR和qRT-PCR。根據GPRV CH-1株保守基因VP7序列設計引物，對從大熊貓糞便中提取到的RNA和實驗室保存病毒液的RNA同時進行反轉錄，將得到的cDNA進行PCR擴增，RT-PCR擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序，最低可以檢測出大約1pg的病毒RNA，該診斷結果重復性較好，可用于GPRV CH-1株的臨床快速診斷。

此外，根據GPRV CH-1株VP4基因序列設計引物，進行qRT-PCR擴增，最低可檢測到的拷貝數為1.0×100拷貝/μl，與常規RT-PCR相比，其靈敏度至少高出100倍，兩種方法的特異性與重復性均較好。

然而，在分子生物診斷中均涉及到陽性對照，目前PCR檢測的陽性對照來自GPRVCH-1病毒株培養后提取RNA反轉錄后得到cDNA作為陽性對照；而對于很多大熊貓等野生動物飼養單位沒有設備和技術條件培養GPRV CH-1病毒株，因此無法獲得PCR檢測中所需要的陽性對照，限制了RT-PCR在基層單位的推廣和應用。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明提供一種大熊貓輪狀病毒CH-1株VP7陽性質粒，通過將VP7陽性質粒轉化到宿主細胞中，再經細胞培養、提取質粒，能夠無限獲取VP7陽性質粒，可實現在基層單位以及不能進行大熊貓輪狀病毒CH-1株病毒培養的單位進行大熊貓輪狀病毒的PCR檢測。

有鑒于此，本發明第一方面提供了一種大熊貓輪狀病毒CH-1株VP7陽性質粒，所述VP7陽性質粒由所述VP7基因和PUC57載體構建而成。

GPRV CH-1株屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒粒子呈球形似車輪狀，直徑70nm。GPRV CH-1株基因組為線狀雙股RNA，它包含11個基因片段，這些基因分別編碼6個結構蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和5個非結構蛋白(NSP1-NSP5)，長度依次分別為3287bp，2717bp，2591bp，2362bp，1356bp，1042bp，1532bp，1042bp，1017bp，750bp，663bp；其中VP4、VP6、VP7是GPRV的主要抗原性基因。