[發明專利]基于氧化損傷堿基的熒光探針及用于直接檢測DNA甲基化的試劑盒與方法

有效

• 申請號: 202010518312.7
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111778316B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 張春陽;張艷;李琛琛
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/682;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

本發明屬于生物分析領域，涉及基于氧化損傷堿基的熒光探針及用于直接檢測DNA甲基化的試劑盒與方法。本發明首次開發了一種基于氧化損傷堿基的熒光探針，通過循環切割信號放大準確檢測單個位點的DNA甲基化。hOGG1酶可以特異性切割8?oxoG/5?mC堿基對中的8?oxoG堿基，但對8?oxoG/U堿基對中的8?oxoG堿基無活性。目標物甲基化DNA的存在可以在hOGG1酶的輔助下誘導熒光探針的循環裂解，從而導致增強的熒光信號。該方法靈敏度高，特異性好,可以檢測單個甲基化位點，檢測下限達到3.458×10^?15M。而且該方法能在復雜的DNA混合體系中區分出0.01％的甲基化水平，也可以檢測基因組中的DNA甲基化水平。

技術領域

本發明屬于生物分析領域，具體涉及基于氧化損傷堿基的熒光探針用于直接檢測DNA甲基化。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

DNA的表觀遺傳修飾無需改變基因編碼序列而發生基因表達的可遺傳變化。DNA甲基化是調節基因轉錄，細胞分化以及包括癌癥在內的多種疾病的致病性的最重要的表觀遺傳事件之一。哺乳動物細胞DNA甲基化幾乎只發生在CpG島的胞嘧啶C-5位。在正常細胞中，跨越啟動子區域的大多數CpG島通常未甲基化，從而轉錄得以開始，因為啟動子的甲基化能夠抑制啟動子的活性。因此，啟動子的甲基化可能是染色體失活和功能喪失突變的另一種基因失活機制。

傳統的DNA甲基化檢測方法主要包括基于甲基化敏感的限制性內切酶消化、親和富集和亞硫酸氫鈉處理。然而，基于甲基化敏感的限制性內切酶消化容易因酶切不完全而導致假陽性結果。基于親和富集的方法涉及甲基化胞嘧啶的特異性抗體或與甲基化豐富的CpG區域有親和力的甲基結合結構域蛋白，它們非常昂貴且不穩定。亞硫酸氫鈉處理可將未甲基化的胞嘧啶脫氨為尿嘧啶，而甲基胞嘧啶保持不變。亞硫酸氫鈉法可區分甲基化胞嘧啶和胞嘧啶，目前被認為是DNA甲基化檢測的金標準。甲基化特異性PCR(MSP)能精確地定位CpG島的甲基化，具有極高的靈敏度，但由于DNA啟動錯誤或亞硫酸氫鈉轉化不完全，它存在假陽性。此外，人們還開發了重甲基和頭環抑制PCR方法來阻斷未甲基DNA的擴增。值得注意的是，基于PCR的方法依賴于嚴格的引物/模板設計和精確優化的熱循環。近年來，在亞硫酸氫鈉處理的基礎上，又出現了一些新的方法，例如依賴連接的檢測法，超支化滾環擴增(HRCA)，二級等溫擴增測定，基于表面等離振子共振(SPR)的測定，基于陽離子共軛聚合物(CCPs)的熒光共振能量轉移(FRET)法用于DNA甲基化測定。但這些方法涉及到復雜的連接反應過程和DNA聚合酶擴增，限制了它們在臨床實驗室的廣泛應用。另外，雖然一些基于亞硫酸氫鈉處理的非PCR方法，如電化學發光法、eMethylsorb法已經被證明可以直接檢測DNA甲基化，但是它們的靈敏度相對較低。

例如：基于PCR的方法通常涉及復雜的操作程序(例如特定的反應溫度和循環數)，極大限制了方法的應用。例如，MS-AP-PCR使用限制性內切酶進行甲基化分析，需要特定的限制性酶切位點和放射性標記。MS-PCR可精確定位CpG島中的甲基化狀態，但它只能提供定性數據而不是定量分析。MS-qFRET有助于直接檢測DNA甲基化，但需要將所有MSP引物的末端都進行標記，操作繁瑣價格昂貴。甲基化DNA沉淀與熒光素酶融合鋅指法的結合(MELZA)需構建要包含谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽的MBD克隆以及GST標記的zif268-熒光素酶，程序比較復雜。基于氧化石墨烯(GO)的電化學方法涉及到GO表面的合成及修飾、金納米顆粒(AuNPs)在碳(GC)電極表面上的堆積等復雜的實驗程序。超支化滾環擴增(HRCA)涉及到連接、酶的消化、擴增等步驟，其過程復雜耗時。NESA方法的靈敏度遠低PCR。目前絕大部分方法都適用于檢測CpG島多個甲基化位點的檢測，但發明人發現：很少有一種方法能直接對基因組DNA進行某一特定單個位點的甲基化分析。

發明內容