[發明專利]一種從動物低核酸含量樣品中提取病毒核酸的方法

在審

• 申請號: 202010517373.1
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111662901A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 梁偉能;賴鑫勇;梁偉滔
• 申請（專利權）人: 佛山市博朋生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州恒華智信知識產權代理事務所(普通合伙) 44299
• 代理人: 張建明

本發明公開了一種能提高動物鼻咽拭子和咬繩唾液等雜質多基質復雜的樣本的前處理方法，包括獲取動物低核酸含量樣品；低核酸含量樣品的保護處理；樣品混合液的離心處理，取下部包含納米磁珠的沉淀部分作為待提取液待用；通過自動核酸提取儀對所述待提取液進行核酸提取等步驟。既能解決柱膜法操作繁瑣，核酸回收率不高，也能解決傳統自動磁珠法上樣量小，不能提取顆粒物附著病毒核酸的問題，充分利用表面修飾磁珠的分散和收集方便的特點，進一步優化了傳統自動磁珠法的操作方式，大大提高了動物鼻咽拭子和咬繩唾液等雜質多、基質復雜的樣本的處理速度和核酸回收率。配合專用的PCR試劑，能較大幅度提高檢測靈敏度，有效減少假陰性的產生。

技術領域

本發明涉及動物疫病檢測技術領域，特別是一種用于早期動物疫病檢測(熒光定量PCR法)前提升核酸提取效率方法，主要應用于從動物鼻咽拭子、咬繩唾液、環境等低核酸含量樣品的核酸提取。

背景技術

在動物的疫病檢測中，病毒核酸作為判斷動物是否患病重要基礎依據，因此，在樣品中提取病毒核酸的效率直接影響疫病檢測判斷的準確性?，F有提取核酸的方法主要有柱膜法和自動磁珠法。

其中柱膜法是將對核酸有吸附作用的官能團固定在離心柱膜上，通過加入不同的裂解試劑、洗滌試劑并反復離心，已達到核酸與雜質分離的目的，得到純化的核酸。優點是得到的核酸純度高，樣品處理量大，缺點是操作繁瑣，核酸回收率低，難于直接處理雜質多的樣品，對吸附在顆粒物中的核酸更是無能為力(因為顆粒物會堵住柱膜，使實驗難以進行，要提取雜質上附著的核酸，必須用稀釋液把核酸從沉淀物中洗脫下來，再離心去沉淀才能過柱，非常麻煩，回收率還低)。

自動磁珠法是在磁珠表面修飾有對核酸有吸附作用的特定活性官能基團，通過不同的裂解液結合液洗滌液在特定的條件下能夠與目的物質進行特異性結合，同時利用磁珠自身的磁性，在外磁場的作用下可以方便的實現定向移動與富集，從而達到核酸與雜質分離的目的，進而實現對目標物質的分離純化，獲得純化核酸。優點是操作簡單，可利用機械化實現高通量操作，配合核酸自動提取儀，在同一時間內可同時實現對數十樣品的處理，效率直接提髙數十倍，極大的縮短了提取時間，滿足了當前生物學高通量操作的要求，使得在大規模疫情爆發時能夠進行快速篩查。此外，磁珠與核酸的特異性結合使得提取率大大增加，使得提取的核酸純度高、濃度大，適合大規模養殖場發病時對無癥狀病例的快速篩查。缺點是取樣量一般只有200到300μL，對感染早期病毒濃度低的樣品就很容易出現漏檢的情況。還有一個比較致命的問題是：部分動物的鼻咽拭子、咬繩中唾液樣本中的病毒帶有電荷，某些病毒會與樣品中牙垢和飼料殘渣緊密結合，而柱膜法或傳統離心法因為不能處理雜質顆粒的原因，需要離心把顆粒物去掉，很大概率會把附著在顆粒物雜質上的病毒核酸也一并去掉，當遇到核酸含量低的樣本時就很容易會導致提取不到足夠的目標核酸，從而導致假陰性的產生。

發明內容

本發明上述問題，提供一種從動物低核酸含量樣品中提取病毒核酸的方法。本發明的技術方案為：

一種從動物低核酸含量樣品中提取病毒核酸的方法，包括以下步驟：

(1)獲取動物低核酸含量樣品；

(2)低核酸含量樣品的保護處理，對低核酸含量樣品添加樣品電荷平衡液，得到樣品混合液；

(3)樣品混合液的離心處理，對樣品混合液中加入納米磁珠，進行離心處理，得到磁珠混合液；

(4)去除所述磁珠混合液上部的上清液，取所述磁珠混合液下部包含納米磁珠的沉淀部分作為待提取液待用；

(5)通過自動核酸提取儀對所述待提取液進行核酸提取，得到病毒核酸。

作為本發明進一步地說明，所述低核酸含量樣品為鼻咽拭子樣品、咬繩唾液樣品和環境樣品。

更進一步地，所述步驟(2)中的電荷平衡液為包含抗生素的PBS溶液。