[發(fā)明專利]一種基于化學酶切法構(gòu)建DNA二代測序文庫試劑盒

在審

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• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111926058A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設計）人: 方小云
• 申請（專利權(quán)）人: 俊兮生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種基于化學酶切法構(gòu)建DNA二代測序文庫試劑盒，所述試劑盒自帶的模塊包括酶切試劑、加A尾、加接頭、PCR擴增、雜交試劑、捕獲試劑和PCR富集；自行采購的商業(yè)試劑有：純化磁珠?貝克曼；鏈霉親和素磁珠?thermo；RNA探針?安捷倫和乙醇?分析純，本發(fā)明樣本產(chǎn)量更高，較物理打斷，化學酶切對低起始量DNA建庫更友好，樣本通量靈活，可同時酶切1?96個樣本，省時高效，建庫成本降低，減少樣本轉(zhuǎn)管的次數(shù)，可以降低樣本轉(zhuǎn)管錯誤造成的樣本混淆錯誤，提高了操作可控性，低質(zhì)量低投入量的DNA通過酶切建庫，其復雜度及插入片段均在可控范圍內(nèi)，適用范圍廣且數(shù)據(jù)可靠。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及試劑盒技術(shù)領域，特指一種基于化學酶切法構(gòu)建DNA 二代測序文庫試劑盒。

背景技術(shù)

FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded)是通過使用石蠟包埋處理福爾馬林固定的樣本，在常溫下可長久保存，因此該處理模式是對腫瘤樣本最常用的樣本儲存手段。FFPE樣本具有以下特點： 1)核酸發(fā)生降解。福爾馬林的固定容易使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解，石蠟的高溫滲入過程進一步加速核酸的降解，保存的時間及環(huán)境也會使得核酸發(fā)生降解。2)分子之間交聯(lián)。福爾馬林的固定容易使組織中分子間交聯(lián)。因此，如何使得FFPE提取的樣本DNA在低質(zhì)量及低起始量下，依然能夠建庫信息完整，是一個難題。

目前的建庫技術(shù)主要依托于NGS，通過DNA片段化、末端修復、加接頭、擴增、雜交捕獲等，獲得可上機測序的文庫。通過上述建庫過程可知，操作繁瑣，極易丟失原始模板信息。因此，報證低質(zhì)量低投入量的DNA建庫可行，是本專利的出發(fā)點。本專利通過建立化學酶切的可操作程序及樣本質(zhì)控方式，根據(jù)樣本情況選擇最優(yōu)的酶切條件，以此來建立一個完整的文庫。相較于物理打斷方式，化學酶切不僅適用樣本質(zhì)量范圍廣，對其樣本起始投入量要求也低，但是建庫質(zhì)量在各方面均不亞于物理打斷的數(shù)據(jù)。

因此，化學酶切滿足FFPE樣本的建庫，并在成本、通量、質(zhì)量、起始量等方面具有比物理打斷顯著的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種基于化學酶切法構(gòu)建DNA二代測序文庫試劑盒，樣本產(chǎn)量更高，較物理打斷，化學酶切對低起始量 DNA建庫更友好，其打斷后經(jīng)過建庫產(chǎn)量更高，復雜度也更高，樣本通量靈活，可同時酶切1-96個樣本，省時高效，建庫成本降低，省卻了特殊儀器及耗材，使得建庫成本有了一定的下降空間，減少樣本轉(zhuǎn)管的次數(shù)，可以降低樣本轉(zhuǎn)管錯誤造成的樣本混淆錯誤，提高了操作可控性，低質(zhì)量低投入量的DNA通過酶切建庫，其復雜度及插入片段均在可控范圍內(nèi)，適用范圍廣且數(shù)據(jù)可靠。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于化學酶切法構(gòu)建DNA二代測序文庫試劑盒，所述試劑盒自帶的模塊包括酶切試劑、加A尾、加接頭、PCR擴增、雜交試劑、捕獲試劑和PCR富集；自行采購的商業(yè)試劑有：純化磁珠-貝克曼；鏈霉親和素磁珠-thermo；RNA探針-安捷倫和乙醇-分析純。

優(yōu)選地，所述試劑盒的使用方法，具體步驟為：

S1：進行化學酶切DNA末端修復DNA；根據(jù)FFPE提取DNA的質(zhì)量進行分級，根據(jù)不同質(zhì)量的DNA匹配相應的酶切時間，活動反應液A；

S2：進行加A尾反應，取用40ul反應液A、8ul加A尾緩沖液和 2ul加A尾酶混合后進行吹打混勻，在65℃反應30分鐘后降至4℃保持，獲得反應液B；

S3：進行加接頭反應，取用60ul反應液B、25ul加接頭緩沖液、 5ul加接頭酶、5ul接頭和5ul水混合后進行吹打混勻，在20℃下反應15分鐘后降至4℃保溫，活動反應液C；

S4：進行第一步純化反應，獲得反應液D；