[發明專利]一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒

在審

• 申請號: 202010515814.4
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111926058A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 方小云
• 申請（專利權）人: 俊兮生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒，其特征在于：所述試劑盒自帶的模塊包括酶切試劑、加A尾、加接頭、PCR擴增、雜交試劑、捕獲試劑和PCR富集；自行采購的商業試劑有：純化磁珠-貝克曼；鏈霉親和素磁珠-thermo；RNA探針-安捷倫和乙醇-分析純。

2.根據權利要求1所述的一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的使用方法，具體步驟為：

S1：進行化學酶切DNA 末端修復DNA；根據FFPE提取DNA的質量進行分級，根據不同質量的DNA匹配相應的酶切時間，活動反應液A；

S2：進行加A尾反應，取用40ul反應液A、8ul加A尾緩沖液和2ul加A尾酶混合后進行吹打混勻，在65℃反應30分鐘后降至4℃保持，獲得反應液B；

S3：進行加接頭反應，取用60ul反應液B、25ul加接頭緩沖液、5ul加接頭酶、5ul接頭和5ul水混合后進行吹打混勻，在20℃下反應15分鐘后降至4℃保溫，活動反應液C；

S4：進行第一步純化反應，獲得反應液D；

S5：進行文庫擴增反應，取用15ul反應液D、25ul擴增混合液和10ul通用引物混合后進行吹打混勻，在95℃下反應5分鐘后降至10℃保溫，獲得反應液E；

S6：進行第二步純化反應，獲得反應液F；

S7：進行雜交反應，獲得反應液G；

S8：進行捕獲反應，獲得反應液H；

S9：進行PCR富集反應，取用20ul反應液H、25ul擴增混合液、2.5ul的Index 5X和2.5ul的Index 7X混合后進行吹打混勻，在95℃下反應45秒后降至10℃保溫，獲得反應液J；

S10：進行第三步純化反應，獲得反應液K；

S11：進行質控品數據分析。

3.根據權利要求2所述的一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒，其特征在于：所述不同質量的DNA包括條帶完整性好，無明顯降解情況的優質DNA、條帶完整性中，降解一般/抹帶情況的良好DNA和條帶完整性差，降解較重/集中在小片段情況的警戒DNA，優質DNA的酶切時間為25-30分鐘，良好DNA的酶切時間為15-20分鐘，警戒DNA的酶切時間為5-10分鐘。

4.根據權利要求2所述的一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒，其特征在于：所述S4進行第一步純化反應，獲得反應液D的具體步驟為：

S41:純化磁珠提前在室溫孵育30 min，使用之前vortex混勻;

S42:取80 ul純化磁珠（樣本：磁珠=1:0.8）加入至加接頭的溶液中，vortex 30s，室溫孵育10min;

S43:配置新鮮的75%乙醇;

S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，將上清液倒出；

S45:加300 ul 75%乙醇，停留1 min，棄去，重復兩次；

S46:離心，棄去殘液，待磁珠干燥；

S47:加水18 ul洗脫磁珠上的DNA，室溫孵育5 min，放置磁力架上，回收，繼續下步操作。

5.根據權利要求2所述的一種基于化學酶切法構建DNA二代測序文庫試劑盒，其特征在于：所述S6進行第二步純化反應，獲得反應液F的具體步驟為：

S61：純化磁珠提前在室溫孵育30 min，使用之前vortex混勻；

S62：取50 ul純化磁珠（樣本：磁珠=1:1）加入至擴增文庫的溶液中，vortex 30 s，室溫孵育10 min；

S63：配置新鮮的75%乙醇；

S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，棄去；

S65：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，棄去，重復兩次；

S66：離心，棄去殘液，待磁珠干燥；

S67：加18 ul水洗脫磁珠上的DNA，室溫孵育5 min，放置磁力架上，回收，用于雜交反應。