[發明專利]一種用熒光法快速檢測水痘病毒滴度的方法

有效

• 申請號: 202010515720.7
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN111579789B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 李春明;趙海波;梁慧穎;閆磊;王瑋;朱曉文;周慧;沈紅杰
• 申請（專利權）人: 長春祈健生物制品有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將二倍體細胞接種于96孔板中，并置于二氧化碳孵箱培養；

(2)將備檢病毒樣品經稀釋后接種至上述96孔板，補加維持液后繼續置于二氧化碳孵箱培養；

(3)將步驟(2)中經培養后96孔板取出，棄去培養液后，經固定液固定后，加入一抗孵育，所述一抗為特異性VZV單抗；

(4)步驟(3)中經一抗孵育的96孔板經洗滌后，加入熒光標記的二抗繼續孵育，所述二抗為抗種屬抗體；

(5)步驟(4)中經二抗孵育的96孔板經洗滌后，用熒光定量檢測儀進行檢測，計算樣品的病毒滴度；

其中，所述特異性VZV單抗為人IgG型單抗，所述單抗輕鏈可變區序列如SEQ ID No：3所示，所述單抗重鏈可變區序列如SEQ ID No：4所示。

2.根據權利要求1所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述的二倍體細胞為對水痘-帶狀皰疹病毒敏感的二倍體細胞，為人胚肺二倍體細胞2BS細胞株、MRC-5細胞株或KMB-17細胞株；

所述二抗為經熒光素標記的抗種屬抗體，包括抗人的抗種屬抗體。

3.根據權利要求1-2任一項所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中的細胞接種數為2×10⁵-5×10⁵/ml，培養條件為35-40℃、二氧化碳濃度為4-6％，培養時間為20-48小時；步驟(2)中培養條件為35-40℃、4-6％二氧化碳濃度，培養60-84小時。

4.根據權利要求3所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中的細胞接種數為2×10⁵-4×10⁵/ml，培養條件為37℃、二氧化碳濃度為5％，培養時間為24小時；

所述步驟(2)中培養條件為37℃、5％二氧化碳濃度，培養72小時。

5.根據權利要求4所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述稀釋為經稀釋液稀釋，稀釋后每孔接種50μl，每個稀釋度接種4-8孔；所述稀釋液為：PBS+50％蔗糖+10％谷氨酸鈉+10％胎牛血清，或者MEM+2％新生牛血清+1％谷氨酰胺+2％NaHCO₃。

6.根據權利要求5所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，每50μl含有病毒數量為2-50PFU。

7.根據權利要求1所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的維持液的配方為：MEM+5％新生牛血清+1％谷氨酰胺，每孔補加150微升維持液；

所述步驟(3)中的固定液為90％乙醇+10％甲醛；所述固定為每孔加入100-300微升固定液，室溫放置10-30分鐘。

8.根據權利要求7所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述固定液為90％乙醇+10％甲醛；所述固定為每孔加入固定液100微升，室溫放置15分鐘。

9.根據權利要求1所述的檢測水痘-帶狀皰疹病毒滴度的熒光檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)和(4)中的孵育條件為：37℃或者室溫，孵育0.5-2小時；或者2-8℃，孵育18-24小時；

所述步驟(4)和(5)中的洗滌使用的洗液為PBST洗滌液，其配方為：PBS+0.5‰-2‰Tween20，洗滌次數為2-5次。