[發(fā)明專(zhuān)利]一種用熒光法快速檢測(cè)水痘病毒滴度的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010515720.7
• 申請(qǐng)日: 2020-06-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111579789B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李春明;趙海波;梁慧穎;閆磊;王瑋;朱曉文;周慧;沈紅杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 長(zhǎng)春祈健生物制品有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/08;G01N33/577
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)水痘?帶狀皰疹病毒(VZV)病毒滴度的抗體及相關(guān)檢測(cè)方法，包括將二倍體細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，然后感染接種未知病毒滴度的樣品，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，通過(guò)加入所述特異性結(jié)合VZV病毒的抗體、FITC標(biāo)記的二抗，進(jìn)行熒光染色，鏡下觀察被感染后的病變數(shù)，得出該樣品病毒滴度的方法。本發(fā)明所提供的方法，特異性強(qiáng)、敏感、快速、易觀察，能夠取得與傳統(tǒng)蝕斑法相同的檢測(cè)準(zhǔn)確度，并能顯著縮短檢測(cè)時(shí)間。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水痘帶狀皰疹病毒滴度檢測(cè)，以及一種用熒光免疫方法建立的、高通量、快速檢測(cè)水痘-帶狀皰疹病毒滴度的方法。

背景技術(shù)：

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)，屬于人皰疹病毒屬，人類(lèi)皰疹病毒3型。最早由日本學(xué)者高橋(Taka-hashiM)于1971年從水痘患兒的皮膚皰疹液中分離得到。后續(xù)研究表明，VZV屬皰疹病毒α亞科，為雙鏈DNA病毒，由124.9kb組成，直徑為150～200nm，含71個(gè)基因組，編碼67種蛋白，但病毒本身只有一個(gè)血清型，具有嗜神經(jīng)性。VZV沒(méi)有動(dòng)物儲(chǔ)存宿主，人是唯一自然宿主。皮膚是病毒的主要靶器官。人類(lèi)初次感染VZV會(huì)引發(fā)水痘，隨后VZV會(huì)潛伏在神經(jīng)節(jié)中，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，再次激活引起帶狀皰疹。

VZV感染表現(xiàn)兩種不同的臨床癥狀。初次感染一般發(fā)生于兒童，表現(xiàn)為水痘，其后病毒進(jìn)入背根神經(jīng)節(jié)并潛伏，在免疫力衰退或免疫抑制等情況下，病毒可能會(huì)將被重新激活，表現(xiàn)為帶狀皰疹(Zerboni,L.等人,2014.NatRev Microbiol12(3):197-210)。帶狀皰疹常伴隨皰疹后神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛疼痛劇烈，可持續(xù)數(shù)年之久，極大影響患者生活質(zhì)量。帶狀皰疹及皰疹后神經(jīng)痛的發(fā)生概率隨年齡增大而增大，這給老齡化社會(huì)造成了較大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。

當(dāng)前對(duì)于水痘帶狀皰疹病毒感染最主要的預(yù)防措施為注射疫苗。當(dāng)前市場(chǎng)上有水痘減毒活疫苗來(lái)預(yù)防水痘，重組亞單位帶狀皰疹疫苗和帶狀皰疹減毒活疫苗來(lái)預(yù)防帶狀皰疹(Brisson,M.etal,2003.J Med Virol 70suppl 1:S31-37；Oxman,N.etal,2005.N Med352(22):2271-2284)對(duì)于已經(jīng)發(fā)病的個(gè)體，當(dāng)前并沒(méi)有有效的、特異的治療手段，而只是通過(guò)抗病毒藥物來(lái)進(jìn)行治療。雖然疫苗和系統(tǒng)性抗病毒劑都已帶來(lái)重大改進(jìn)，但是該疾病仍持續(xù)存在。更有效地檢測(cè)和阻斷VZV在種群中感染和繁殖的新抗體和抗體片段的鑒定以及生產(chǎn)，對(duì)于建立這種感染性疾病的治療和/或預(yù)防的改進(jìn)治療是特別重要的。

對(duì)于疫苗企業(yè)來(lái)說(shuō)，水痘減毒活疫苗的疫苗滴度的檢測(cè)是非常重要的。蝕斑法是目前我國(guó)使用的對(duì)水痘病毒滴度測(cè)定的常規(guī)方法，其簡(jiǎn)要過(guò)程如下：首先在6孔板內(nèi)接種細(xì)胞，一般為2x10⁵-4x10⁵/ml，每孔接種3ml；37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)3天；接種病毒；37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)7天；最后用考馬斯亮藍(lán)染色，人工計(jì)數(shù)每孔蝕斑數(shù)量。

蝕斑法滴度檢測(cè)方法滴定復(fù)孔數(shù)是2個(gè)，存在復(fù)孔數(shù)不足帶來(lái)的方法上的不準(zhǔn)確性；蝕斑法整個(gè)流程檢測(cè)時(shí)間為10天，不能短時(shí)間得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果；蝕斑法需要實(shí)驗(yàn)人員用肉眼計(jì)數(shù)斑點(diǎn)，人為誤差難于控制。因此，目前急需一種能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)水痘-帶狀皰疹病毒滴度的方法。

本發(fā)明人將熒光免疫方法的靈敏性、特異性應(yīng)用于病毒滴度檢測(cè)上，開(kāi)發(fā)了一種用于水痘帶狀皰疹病毒滴度檢測(cè)的方法。熒光法是利用抗原抗體結(jié)合的特異性和熒光法的高靈敏性相結(jié)合的方法應(yīng)用于病毒滴度檢測(cè)領(lǐng)域。首先該方法在實(shí)驗(yàn)中可以設(shè)置4-8個(gè)復(fù)孔，顯著提高滴度檢測(cè)的準(zhǔn)確性；其次該方法整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程耗時(shí)為5天，相比于蝕斑法全程需要10天，實(shí)驗(yàn)時(shí)間減少一半；再次該方法可以在熒光酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀上自動(dòng)讀板計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，減少了人工成本，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度和實(shí)驗(yàn)的人為誤差；再有該方法的自動(dòng)化讀板和計(jì)數(shù)符合GMP數(shù)據(jù)完整性的要求。該方法具有快速、特異、準(zhǔn)確、通量高，可以自動(dòng)化計(jì)數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，可望成為水痘帶狀皰疹病毒滴度檢測(cè)的備選(替代)方法。兩種方法的比較見(jiàn)下表。