[發明專利]鏈置換引物和細胞轉錄組文庫構建方法

有效

• 申請號: 202010515520.1
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111549025B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 徐家偉;姚歡;孫瑩璞;楊運桂;張楠;郭佳;楊瑩
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣東廣和律師事務所 44298
• 代理人: 董前進

本發明提供一種單細胞全轉錄組文庫構建方法，其中本發明單細胞全轉錄組文庫構建方法包括步驟：（A）逆轉錄細胞RNA，以產生相應于所述細胞RNA的第一鏈cDNA，其中逆轉錄RNA所使用的鏈置換引物的5′末端帶有多個dSpacer，且所述鏈置換引物帶有長度為4的隨機序列；（B）由所述第一鏈cDNA產生相應的第二鏈cDNA，從而產生雙鏈cDNA；（C）通過PCR擴增所述雙鏈cDNA，其中PCR擴增所使用的擴增引物的5′末端帶有T7啟動子序列和（D）通過T7 RNA聚合酶轉錄PCR擴增得到的cDNA，本發明單細胞全轉錄組文庫構建方法受轉錄本本身的含量影響小和能夠準確反應樣品中RNA的含量而不會受到PCR重復讀長的影響，且其流程簡單易行，成本低廉。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種鏈置換引物，其適用于用于逆轉錄RNA。進一步地，本發明還涉及一種細胞轉錄組文庫構建方法。

背景技術

RNA測序技術是生物醫學領域常用的重要技術手段之一。特別是，對單個細胞的全轉錄組進行測序，可以觀察和研究不同細胞內，甚至相同細胞在不同時期，其RNA表達情況和變化規律。RNA測序技術在生物醫學諸多分支，如發育生物學、腫瘤學、基因組學等研究中起到重要作用。

近10年來，轉錄組測序技術方法發展迅速。目前RNA測序已經從大量經過純化的RNA(10ng以上)發展為直接對單細胞中RNA進行測序和RNA建庫。從測序內容上看，RNA測序可以分為信使RNA(mRNA)測序和全轉錄組測序。mRNA是編碼蛋白質的信號RNA分子，這種RNA的特點是具有多聚腺苷酸的尾巴和帽子結構。隨著RNA研究的深入，人們發現基因組上存在大量的轉錄區域，這些可轉錄區域產生了大量的非編碼RNA，發揮重要的功能。隨著測序技術的發展和研究的深入，通過全轉錄組測序的方法鑒定和研究非編碼RNA的功能已經成為RNA研究領域的前沿熱點。

由于RNA是單鏈結構，對RNA測序需要得到其序列方向信息。RNA的方向性信息對于非編碼RNA的研究非常重要，尤其是在對沒有參考序列(新的轉錄本)的轉錄本的鑒定時，是必需的。同時根據研究要求，需要對RNA的轉錄起始位點和3′端的加工情況進行識別，和針對RNA的末端序列進行測序，這種方法稱為快速cDNA末端擴增(Rapid Amplication cDNAEend,RACE)。但是常用的隨機引物無法保證從RNA的末尾開始啟動反轉錄，因此利用隨機引物反轉錄得到的文庫并不能對RNA的末端進行準確的檢測。目前常用的smart-seq測序中，利用了dT(15)-VN的設計來優化反轉錄的起始位置。由于mRNA的末端有幾個到幾百個的腺苷酸尾巴，在多聚胸腺嘧啶(poly dT)的后面接上非胸腺嘧啶堿基有利于提高反轉錄從3′端末尾起始的比例，但是由于A-T配對的不穩定，這種方法并不能保證反轉錄都從3′端開始。

因此，高通量單細胞RNA測序的核心在于單細胞RNA的標記。目前常用方法是在反轉錄過程中引入標簽序列(Barcode)。具體為在cDNA的5′端或者3′端引入單細胞的特異標簽序列。這種方法的特點是每個mRNA最后都只能得到一個讀取(Read)。目前所有的單細胞RNA測序都需要利用mRNA3′端是多聚腺苷酸化的尾巴，利用多聚胸腺嘧啶引物進行反轉錄能達到兩個目的:一個是可以有效地避免核糖體RNA,轉運RNA等非poly A尾巴RNA的影響。同時由于尾巴處的poly A序列和dT隨機引物之間的配對對于每種mRNA分子是一樣的(polyA尾巴太短除外)，這樣反轉錄對于不同豐度的mRNA的擴增是一致的。值得注意的是poly(dT)引物進行反轉錄的特異性有限，存在從mRNA的中間處而不是3′端啟始反轉錄的情況。