[發明專利]鏈置換引物和細胞轉錄組文庫構建方法

有效

• 申請號: 202010515520.1
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111549025B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 徐家偉;姚歡;孫瑩璞;楊運桂;張楠;郭佳;楊瑩
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣東廣和律師事務所 44298
• 代理人: 董前進

1.一種細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，包括下述步驟：

（A）逆轉錄細胞 RNA，以產生相應于所述細胞 RNA 的第一鏈 cDNA，其 中逆轉錄 RNA所使用的鏈置換引物的 5′末端帶有多個 dSpacer，且所述鏈置換引 物帶有長度為 4 的隨機序列；

（B）由所述第一鏈 cDNA 產生相應的第二鏈 cDNA，從而產生雙鏈 cDNA；

（C）通過 PCR 擴增所述雙鏈 cDNA，其中 PCR 擴增所使用的擴增引物的 5′

末端帶有 T7 啟動子序列；和

（D）通過 T7 RNA 聚合酶轉錄 PCR 擴增得到的 cDNA。

2.根據權利要求 1 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（E）轉錄結束后，去除 T7 RNA 聚合酶轉錄反應體系中的模版 DNA 和核糖體 RNA，其中該步驟（E）位于步驟（D）之后。

3.根據權利要求2 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（M）去除所述細胞 RNA 的 3′末端的磷酸基團，并在所述細胞 RNA 的 3′ 末端添加腺苷酸化 DNA 寡聚脫氧核糖核苷酸銜接子，其中該步驟（M）位于步驟（A）之前。

4.根據權利要求3 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（L）裂解細胞，并提取細胞裂解產物中的總 RNA 和片段化所述總 RNA，以得到細胞RNA，其中該步驟（L）位于步驟（M）之前。

5.根據權利要求1 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（F）對轉錄 cDNA 得到的 RNA 測序。

6.根據權利要求2 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（G）對去除核糖體 RNA 后的 RNA 測序。

7.根據權利要求4 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，當裂解所述細胞時，向裂解液中加入 DNA 探針。

8.根據權利要求 1 所述的細胞轉錄組文庫構建方法，其特征在于，進一步包括下述步驟：

（M）去除所述細胞 RNA 的 3′末端的磷酸基團，并在所述 RNA 的 3′末端添加腺苷酸化 DNA 寡聚脫氧核糖核苷酸銜接子，其中該步驟（M）位于步驟（A）之前。

9.一種細胞 cDNA 文庫構建方法，其特征在于，包括下述步驟：

（A）逆轉錄細胞 RNA，以產生相應于所述細胞 RNA 的第一鏈 cDNA，其 中逆轉錄 RNA所使用的鏈置換引物的 5′末端帶有多個 dSpacer，且所述鏈置換引 物帶有長度為 4 的隨機序列；

（B）由所述第一鏈 cDNA 產生相應的第二鏈 cDNA，從而產生雙鏈 cDNA；

和

（C）通過 PCR 擴增所述雙鏈 cDNA，其中 PCR 擴增所使用的擴增引物的 5′

末端帶有 T7 啟動子序列。