[發(fā)明專利]一種檢測血液BCR重鏈和輕鏈的引物及免疫組庫方法、應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010511284.6
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111599411B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設計）人: 李捷;吳小雷;吳永鵬
• 申請（專利權）人: 譜天（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

本發(fā)明提供了一種檢測血液BCR重鏈和輕鏈的免疫組庫信息分析方法，具體包括參考序列構建、測序數(shù)據(jù)預處理、Paired?Reads合并、Merge后的數(shù)據(jù)與參考序列進行比對、比對結果過濾及統(tǒng)計分析，同時，還提供了一種檢測血液BCR的免疫組庫方法，該方法中采用了上述信息分析方法，通過設計血液BCR重鏈和輕鏈的引物組合實現(xiàn)對CDR3區(qū)域序列的測序分析，是首次應用于兔子進行BCR的免疫組庫重鏈和輕鏈的檢測方法，通過對血液B細胞的免疫組庫測序研究與抗體產生相關的CDR3序列信息，實現(xiàn)更深入的了解抗體產生的規(guī)律，同時結合基因克隆，細胞轉染，蛋白測定與純化等技術，探索出體外高效快速合成特異性抗體的新途徑。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域的免疫組庫測序技術方向，具體涉及一種基于多重PCR和高通量測序檢測血液DNA的BCR重鏈和輕鏈專用引物組及免疫組庫文庫構建方法，進一步涉及一種檢測血液BCR重鏈和輕鏈的引物及免疫組庫方法、應用。

背景技術

人體內的免疫細胞主要包括T細胞和B細胞。T細胞抗原受體是特異性識別和結合抗原肽-MHC分子的分子結構，大部分T細胞受體由α和β兩種肽鏈組成，少數(shù)T細胞受體由γ和δ兩種肽鏈組成，其中α和β兩條肽鏈的可變區(qū)(V區(qū))在免疫細胞成熟過程中發(fā)生基因重排，從而形成了多種重組序列片段，導致T細胞呈現(xiàn)出多樣性。B細胞抗原受體是B細胞表面識別抗原的一種免疫球蛋白，具有抗原結合特異性，B細胞受體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中可變區(qū)(V區(qū))由VH和VL兩個結構域構成，它們排列順序和氨基酸組成都呈現(xiàn)出高度多樣性。

在任何特定時間內，某個個體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細胞或者T細胞的多態(tài)性總和，被稱為免疫組庫(immune?repertoire，IR)。它既是個體免疫狀態(tài)的“快照”，又是個體免疫接觸史的“全紀錄”。T細胞、B細胞分別負責細胞免疫和體液免疫。人體的免疫能力很大程度上依賴于T細胞和B細胞的多樣性。T細胞受體(T?cell?receptor，TCR)和B細胞受體(B?cell?receptor，BCR)由多條肽鏈組成，具有抗原結合特異性，每條肽鏈的互補決定區(qū)(complementarity-determining?region，CDR，又稱超變區(qū))氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性，構成容量巨大的TCR和BCR庫。TCR或BCR的基因多樣性，一方面通過組合多樣性、連接多樣性等胚系基因重排而獲得(即由多個不連續(xù)功能性的V、D、J、C基因片斷重排)，另一方面通過核苷酸的隨機插入、剪接、二次重排等獲得，形成多樣性的抗原互補決定區(qū)(CDR1、CDR2、CDR3)。其中CDR3最能直接反應TCR或BCR的多樣性。T細胞和B細胞對眾多抗原的識別依賴于CDR3區(qū)的多樣性，故對TCR?CDR3區(qū)、BCR?CDR3區(qū)序列的分析，可作為判別細胞抗原識別特性的重要指標。研究免疫組庫有助于了解個體的免疫狀態(tài)，分析疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后。

至今免疫組庫研究技術主要經歷了3個階段。從最初的流式細胞術分析T細胞各亞家族的分布與缺失，到免疫掃描譜系分析技術研究各亞家族CDR3基因長度的多態(tài)性，再到如今高通量測序技術能夠完整的檢測所有T細胞、B細胞的CDR3序列，并能實現(xiàn)T細胞α、β雙鏈測序，B細胞輕重鏈(HL鏈)同時測序。前兩種技術都只能從一定程度上反映T、B細胞的克隆性分布，而高通量測序技術能夠同時分析所有T、B細胞CDR3序列，真實地反映所有TCR、BCR的遺傳信息，較全面地揭示TCR、BCR免疫組庫的復雜性和多樣性，是免疫組庫研究最具劃時代意義的重要技術。高通量測序技術的發(fā)展將免疫組庫研究推向新的階段。免疫組庫測序技術(immune?repertoire?sequencing，IR-SEQ)主要通過5’RACE或者多重PCR技術將免疫球蛋白重鏈(IGH)或者T細胞受體β區(qū)多態(tài)性最高的互補決定區(qū)(CDR3)捕獲下來，然后進行高通量深度測序，在此基礎上研究B細胞或者T細胞的多態(tài)性，是當今一大研究亮點。