[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)血液BCR重鏈和輕鏈的引物及免疫組庫(kù)方法、應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010511284.6
• 申請(qǐng)日: 2020-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111599411B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李捷;吳小雷;吳永鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 譜天（天津）生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G16B30/00
• 分類(lèi)號(hào): G16B30/00;C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 南京中律知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種檢測(cè)血液BCR重鏈和輕鏈的免疫組庫(kù)信息分析方法，其特征在于，包括步驟

（1）參考序列構(gòu)建：

從國(guó)際免疫遺傳信息系統(tǒng)IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中下載?V、?D、?J?基因的所有序列構(gòu)成模板序列，再將特異性的引物與?V、?D、?J所有序列進(jìn)行比對(duì)，?引物與模板序列小于等于?3?個(gè)錯(cuò)配的位置都保留下來(lái)，從引物的起始位置開(kāi)始至能形成?PCR?產(chǎn)物的部分作為參考序列，若引物與模板序列存在錯(cuò)配，則生成?2?條參考序列；對(duì)于構(gòu)建成的參考序列庫(kù)，進(jìn)行合并，去除重復(fù)的參考序列，保留一條；參考序列構(gòu)建完成后，序列?id?上已經(jīng)明確了?CDR3?起始、終止位置信息；

（2）測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理：

獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，數(shù)據(jù)預(yù)處理包括去除接頭?adapter污染序列、低質(zhì)量序列、N?比率過(guò)高序列；

（3）雙端序列Paired?Reads合并：

利用拼接原理，把測(cè)序得到的雙端末尾序列Paired-end?reads進(jìn)行拼接合并，即重疊區(qū)Contigs；

（4）雙端末尾序列Paired-end?reads合并后的數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行比對(duì)：

拼接好的序列重疊區(qū)contigs與構(gòu)建好的參考序列進(jìn)行序列對(duì)位的比對(duì)，序列與?V、D、?J?分開(kāi)比對(duì)；重新比對(duì)，找出最佳比對(duì)及精確比對(duì)位置，方法為：根據(jù)序列對(duì)位blast?的比對(duì)結(jié)果，V向?3’端延伸，?D?向兩端延伸，?J?向?5’端延伸，進(jìn)行重新比對(duì)、計(jì)算得分和identity；對(duì)?V、D、J分別選出得分最高的比對(duì)結(jié)果作為最佳比對(duì)；為了精確?V、D、J?的比對(duì)位置，在特定區(qū)域設(shè)定有限的錯(cuò)配mismatch數(shù)目；對(duì)V、?J，屬于?CDR3?的部分設(shè)定一定的錯(cuò)配mismatch，對(duì)?D，在整個(gè)比對(duì)區(qū)域設(shè)定一定的錯(cuò)配mismatch；具體設(shè)定的錯(cuò)配mismatch數(shù)目因不同的鏈而有區(qū)別；

（5）比對(duì)結(jié)果過(guò)濾：

過(guò)濾過(guò)程包括但不限于以下任意一種：低頻率序列、缺少?V?基因或者?J?基因的序列、V基因與?J?基因比對(duì)正負(fù)鏈不一致的序列、比對(duì)到假基因上的序列、翻譯成氨基酸序列，如果含有終止子、開(kāi)發(fā)閱讀框內(nèi)的堿基長(zhǎng)度不為?3?的倍數(shù)；

（6）統(tǒng)計(jì)分析：根據(jù)?CDR3?的位置，把?DNA?序列翻譯成氨基酸序列，并統(tǒng)計(jì)多肽的頻率信息；經(jīng)過(guò)過(guò)濾，得到可靠的比對(duì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)V、D、J基因的使用頻率、插入缺失、長(zhǎng)度、堿基組成，免疫多樣性情況信息，繪制V、J基因表達(dá)的?2D、3D?圖，呈現(xiàn)免疫組庫(kù)多樣性。

2.一種血液BCR重鏈和輕鏈的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法，其特征在于，包括BCR重鏈和輕鏈的多重PCR擴(kuò)增、根據(jù)illumina測(cè)序儀適配接頭序列進(jìn)行的第二次PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序、權(quán)利要求1所述的免疫組庫(kù)信息分析方法進(jìn)行的信息分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法，其特征在于，?PCR擴(kuò)增含有2組引物，第一組P1為混合引物mix，是多重PCR擴(kuò)增的引物對(duì)，第二組P2為上游引物、下游引物，是根據(jù)illumina測(cè)序儀適配接頭序列進(jìn)行的第二次PCR擴(kuò)增的引物對(duì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法，其特征在于，多重PCR的擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性45s；98℃變性10s，60℃退火1min，72℃延伸45s，共15-25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min；4℃保持；第二步PCR的擴(kuò)增條件為PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性45s；98℃變性10s，63℃退火30s，72℃延伸30s，共15-25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min；4℃保持。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法，其特征在于，第一組P1的混合引物mix，包含有至少一組引物對(duì)，該引物對(duì)包含多個(gè)BCR的V區(qū)或C區(qū)亞型。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法，其特征在于，第一組P1的上游引物共24條，序列分別如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.24所示，下游引物共10條，序列分別如SEQ?IDNO.25～?SEQ?ID?NO.34所示。