[發(fā)明專利]一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定葡萄糖氧化酶及其在檢測葡萄糖中的應用

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• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111595800A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設計）人: 王潤偉;王春艷;王歡;田牧曉;于蕙源;所金泉;王媛
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12N9/04;C12N11/14;C12Q1/54
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶及其在檢測葡萄糖中的應用，屬于葡萄糖檢測技術領域。本發(fā)明是以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅納米為載體，吸附葡萄糖氧化酶制得該固定化葡萄糖氧化酶(GOD@ADMSNs)。制備過程中，利用三乙胺調控介孔二氧化硅納米材料的結構，得到孔徑均一、尺寸為200nm，孔隙為10～25nm的樹枝狀介孔二氧化硅納米材料，該材料具有樹枝狀皺襞孔隙，其大小與葡糖糖氧化酶分子大小相似，載體上面的氨基與酶分子上的羧基結合，而不影響酶的活性位點，使固定化酶保持較高的活性和較高的重復使用性。在重復檢測葡萄糖36次后，GOD@ADMSNs的活性仍在80％以上，與有關報道的固定化葡萄糖氧化酶相比，重復檢測次數(shù)顯著增加，極大降低了檢測的使用成本。

技術領域

本發(fā)明屬于葡萄糖檢測技術領域，具體涉及一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化 硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶及其在檢測葡萄糖中的應用。

背景技術

葡萄糖是動植物碳水化合物的主要成分，葡萄糖的定量測定在生命科學中占 有重要地位，葡萄糖的檢測方法主要有分光光度法、安培法、高效液相色譜法、 極譜法和毛細管電泳法等，但多數(shù)存在耗時、昂貴的缺點。酶是一類具有較高催 化活性的生物催化劑，有較高的底物特異性，葡萄糖氧化酶可催化β-D-葡萄糖 氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫，酶法檢測葡萄糖具有準確快速，靈敏度高的特點。 近年來，葡萄糖氧化酶法已廣泛應用于生物化學、臨床化學及食品分析中葡萄糖 的檢測，酶在正常條件下表現(xiàn)出很高的選擇性和反應性，但對pH和溫度較敏感 而易失活，游離酶價格昂貴使用一次后不能回收利用，增加了使用成本。

酶的固定化在很大程度上能夠解決此類問題，固定化葡萄糖氧化酶檢測葡萄 糖具有反應時間短、保存期較長、靈敏度高、反應快捷等優(yōu)點。酶固定化方法有 物理法和化學法兩大類，其中物理法包括吸附法和包埋法,化學法包括共價結合 法和交聯(lián)法等。由于傳統(tǒng)方法所制備的固定化葡萄糖氧化酶的酶活保留率較低， 固定化葡萄糖氧化酶在使用一定時間及次數(shù)后，酶活力明顯下降，大大降低了酶 的應用性能。

因此有必要尋求一種合適的載體，來固定葡萄糖氧化酶，使固定化葡萄糖氧 化酶具有更高的的重復使用性，更高的穩(wěn)定性，從而達到降低使用成本的目的。

介孔二氧化硅具有可調的孔徑尺寸和結構、比表面積高、孔隙率高、熱穩(wěn)定 性和機械穩(wěn)定性高、本身無毒等特點，可在粒子表面進行選擇性功能化。其中， 樹枝狀介孔二氧化硅納米材料具有樹枝狀空腔結構，因而具有更高的孔滲透性、 更大的孔體積、更好的粒子內表面的可接觸性。因而成為一種優(yōu)良的酶固定化載 體。

樹枝狀介孔二氧化硅納米材料是一種特殊形貌的酶固定化載體，比傳統(tǒng)的介 孔二氧化硅材料增加了優(yōu)勢：(1)它的整體形貌為樹枝狀，開放性好，內有樹枝 狀空腔，存在10～25nm的內部外部堆積孔。(2)可調控性強，由于表面含有裸 露的硅羥基，能夠和功能化硅烷縮合，形成帶有功能基團(巰基、氨基、羧基) 的表面，且可調控其形貌，包括納米粒子大小、孔徑大小等。本發(fā)明利用3-氨基 丙基三乙氧基硅烷對樹枝狀介孔二氧化硅納米材料進行修飾氨基，合成氨基化樹 枝狀介孔二氧化硅納米材料。(3)材料穩(wěn)定性較高，不易被破壞。(4)較大的比 表面積可以提高酶的蛋白載量。這些性能都充分說明樹枝狀介孔二氧化硅納米材 料是一種優(yōu)良的酶固定化載體。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是合成一種氨基化的樹枝狀介孔二氧化硅納米材料，并用此材 料作為載體來固定葡萄糖氧化酶，載體上的氨基與葡萄糖氧化酶分子上的羧基結 合，克服現(xiàn)有的酶固定化技術酶活保留率低，重復使用性低的問題。樹枝狀介孔 二氧化硅具有較大的孔道、較高的比表面積和良好的生物相容性，因此具有較大 的蛋白負載潛力。然而，使用這些納米顆粒固定化酶的應用很少有報道。

本發(fā)明的另一目的是提供以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡 萄糖氧化酶在血糖及飲料樣品中檢測葡萄糖方面的應用。該方法具有穩(wěn)定性高、 反應時間短、靈敏度高、重復使用次數(shù)顯著提高的效果，以及成本低、溫度、酸 堿適用范圍廣等優(yōu)于天然游離酶的優(yōu)點。