[發明專利]一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定葡萄糖氧化酶及其在檢測葡萄糖中的應用

在審

• 申請號: 202010511039.5
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111595800A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 王潤偉;王春艷;王歡;田牧曉;于蕙源;所金泉;王媛
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;C12N9/04;C12N11/14;C12Q1/54
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

1.一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶，其是由如下步驟制備得到：

(1)樹枝狀介孔二氧化硅納米材料的制備：將0.68g三乙胺溶于15～30mL超純水，75～85℃下水浴25～35min；然后加入0.38g十六烷基三甲基溴化銨和0.16g水楊酸鈉，75～85℃下水浴25～35min；再加入4mL體積分數98％的正硅酸乙酯，75～85℃下水浴1.5～2.5h；降至室溫后離心，沉淀用超純水和乙醇洗滌后干燥，經萃取去除模板劑，得到樹枝狀介孔二氧化硅納米材料，記為DMSNs；

(2)氨基化樹枝狀介孔二氧化硅納米載體的制備：將0.3～0.5g步驟(1)制備的DMSNs加到60～100mL甲苯中，加熱至澄清后再加入0.3～0.5mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，DMSNs與3-氨基丙基三乙氧基硅烷的用量比例為1g：1mL，加熱回流3～5h，降至室溫后離心，沉淀用甲苯清洗，干燥后研磨得到氨基化樹枝狀介孔二氧化硅納米載體，記為ADMSNs；

(3)固定葡萄糖氧化酶：取6份10mg步驟(2)得到的ADMSNs，分別加入到10mL濃度分別為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液中；然后在轉速為150～200r/min，4℃的水浴磁力攪拌器上攪拌4～12h，離心，所得沉淀用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌后凍干，得到以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅納米材料為載體的固定化葡萄糖氧化酶，記為GOD@ADMSNs。

2.如權利要求1所述的一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：不同濃度葡萄糖氧化酶溶液的配制，是準確稱取葡萄糖氧化酶0.05g，用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至50mL，得到濃度為1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液；再用50mM的pH＝5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液將濃度為1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液稀釋成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的濃度。

3.如權利要求2所述的一種以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：50mM的pH＝5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液的配制，是首先稱取4.10g無水乙酸鈉，用超純水溶解并定容至1000mL，得到50mM的乙酸鈉溶液；再量取2.86mL冰乙酸，用超純水定容至1000mL，得到50mM的乙酸溶液；然后量取乙酸鈉溶液，用乙酸溶液調節pH，即得到50mM的pH＝5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液。

4.權利要求1、2或3所述的以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶在檢測葡萄糖中的應用。

5.如權利要求4所述的以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶在檢測葡萄糖中的應用，其步驟如下：

(1)顯色液配制：A液：0.015g 4-氨基安替比林溶于50mL的pH＝5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；B液：0.103g苯酚溶于50mL超純水，A液與B液混合后加入2mg辣根過氧化物酶即得到顯色液；

(2)將6份質量為3mg的GOD@ADMSNs分別加入到3mL顯色液，0.5mL超純水，0.5mL濃度分別為0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.0100mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.500mg/mL的葡萄糖標準溶液中，在40℃，150～200rpm的水浴磁力攪拌器上反應15～30min；離心，取上清液，用紫外分光光度計測定上清液在505nm處的吸光度值，然后以葡萄糖標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做濃度-吸光度標準曲線；

(3)將3mg GOD@ADMSNs加入到3mL步驟(4)得到的顯色液和0.5mL超純水的混合溶液中，再加入0.5mL的未知濃度的葡萄糖溶液，在40℃，150～200rpm的水浴磁力攪拌器上反應15～30min，離心，取上清液，用紫外分光光度計測定上清液在505nm處的吸光度值，將該吸光度值代入步驟(5)得到的濃度-吸光度標準曲線中，計算得到該葡萄糖溶液的濃度，從而實現對葡萄糖濃度的定量檢測。

6.如權利要求5所述的以氨基化樹枝狀介孔二氧化硅為載體的固定化葡萄糖氧化酶在檢測葡萄糖中的應用，其特征在于：不同濃度葡萄糖標準溶液的配制，是將50mg葡萄糖用超純水溶解并定容至100mL得到濃度為1mg/mL的葡萄糖標準溶液，再用超純水稀釋成濃度分別為0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.010mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.500mg/mL的葡萄糖標準溶液。