[發(fā)明專利]一種檢測大氣環(huán)境中四環(huán)素類耐藥基因tetA的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010510793.7
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111607655A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪慶;梁海崟;楊光;王麗濤;楊衛(wèi)華;侯立泉;任曉芬
• 申請（專利權(quán)）人: 河北工程大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 天津耀達(dá)律師事務(wù)所 12223
• 代理人: 侯力

1.一種檢測大氣環(huán)境中四環(huán)素類耐藥基因tetA的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，堿基序列為：

正向引物：GCTACATCCTGCTTGCCTTC；

反向引物：CATAGATCGCCGTGAAGAGG。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的引物序列檢測大氣環(huán)境中四環(huán)素類耐藥基因tetA的方法，其特征在于，包括：

(1)將已知濃度的四環(huán)素類耐藥基因tetA的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；提取標(biāo)準(zhǔn)樣品四環(huán)素類耐藥基因tetA中的DNA，以此提取出來的DNA作為模板，利用權(quán)利要求1中的引物序列對模板DNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，當(dāng)達(dá)到熒光閾值時，記錄得到的循環(huán)數(shù)；

(2)運(yùn)用步驟(1)中得到的達(dá)到熒光閾值時的循環(huán)數(shù)，根據(jù)定量PCR測定目的基因tetA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；運(yùn)用10倍梯度稀釋法，利用已知濃度模板起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品做出目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的C_T值為縱坐標(biāo)，使標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，10⁸，確保R²0.99，擴(kuò)增效率在90％-110％之間時為有效曲線；

(3)按照步驟(1)所述方法確定大氣環(huán)境樣品中四環(huán)素類耐藥基因tetA的循環(huán)數(shù)，將得到的目標(biāo)待測基因tetA的循環(huán)數(shù)代入步驟(2)繪制的標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算得到目標(biāo)大氣環(huán)境樣品中四環(huán)素類耐藥基因tetA的含量。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反應(yīng)體系為25μL：其中包括2μL的模板DNA 1-10ng，各0.5μL的正、反向引物10μM，12.5μL的2×Premix Ex TaqTM和9.5μL的無菌雙蒸水；PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10min；40個循環(huán)的95℃保持20s進(jìn)行變性，57℃保持20s進(jìn)行退火和72℃保持30s進(jìn)行延伸；72℃保持5min完全延伸。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用苯酚-氯仿-異戊醇抽提法將目標(biāo)大氣環(huán)境樣品中的四環(huán)素類耐藥基因tetA的DNA提取出來。

5.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述目的基因tetA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法如下：

采用權(quán)利要求1設(shè)計的雙向引物，將從目的基因tetA標(biāo)準(zhǔn)樣品提取出來的DNA作為模進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒回收并純化，純化后的DNA產(chǎn)物與載體鏈接后轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，加入LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

將培養(yǎng)好的感受態(tài)細(xì)胞涂抹在含IPTG、X-gal和青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上；通過藍(lán)白斑篩選法挑取白色重組菌斑上的陽性克隆子，用含青霉素的LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)；

用質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒，切膠后送樣測序，檢測插入基因片斷序列；符合要求的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。