[發明專利]一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的方法

在審

• 申請號: 202010510793.7
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111607655A
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 汪慶;梁海崟;楊光;王麗濤;楊衛華;侯立泉;任曉芬
• 申請（專利權）人: 河北工程大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 天津耀達律師事務所 12223
• 代理人: 侯力

本發明公開了一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的方法。包括：(1)將已知濃度的四環素類耐藥基因tetA的標準樣品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR反應，利用設計引物序列對模板DNA進行定量PCR擴增，記錄得到的循環數；(2)運用10倍梯度稀釋法，利用已知濃度模板起始拷貝數標準樣品做出目的基因的標準曲線；(3)按照步驟(1)方法確定大氣環境樣品中四環素類耐藥基因tetA的循環數，利用步驟(2)繪制的標準曲線，計算得到目標基因tetA的含量。本發明使用定量PCR技術即可快速精確地檢測到大氣環境中待測樣品中四環素耐藥基因tetA的濃度含量。

技術領域

本發明屬于環境生物學領域，具體涉及一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的方法。

背景技術

空氣污染嚴重影響著人類健康，特別是在工業化和城市化快速崛起的發展中國家，大氣中顆粒物的增加，導致公共健康存在極大潛在風險。近年來，我國華北地區持續出現多起時間較長的霧霾重污染天氣，大氣污染隨之也被提升到國家重點治理層面。

抗生素是指由微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，是一種能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質，現已廣泛用于醫療及畜禽養殖等行業。在為人類帶來重要貢獻的同時，抗生素的大量使用，導致人體及動物腸道內誘導出抗性菌株，以排泄物等形式釋放到環境中，并可通過與細胞中的可移動因子(如質粒、轉座子、基因盒等)相結合，在不同的細菌群體間傳播，進而擴散到水、大氣、土壤等各種環境介質中，造成抗生素耐藥基因污染。抗生素濫用造成的環境污染問題已引起全球的高度重視。

到目前為止，盡管大量文獻報道了有關抗生素耐藥基因方面的研究，但對大氣環境中耐藥基因的研究甚少，尤其是對近年來引起極度重視的霧霾天氣中PM_2.5和PM₁₀耐藥基因的研究更少。細菌作為PM_2.5和PM₁₀中豐富的原核生物，在一定條件下可誘導為耐藥菌，對人體產生直接或間接影響。尤其在霧霾環境下，暴露在高濃度PM_2.5和PM₁₀中的人群，很容易吸入攜帶抗生素耐藥基因的病原微生物。因此，為深入研究大氣環境中耐藥基因的來源、分布及傳播擴散機理，大氣中耐藥基因的檢測是當務之急。

四環素類耐藥基因作為在水、土壤、大氣等環境介質中檢測到最廣泛的基因類型之一，目前研究其耐藥性主要采用可培養微生物法，然而此方法對不可培養微生物的耐藥基因卻無法檢測。

發明內容

本發明的目的是解決不可培養微生物的耐藥基因在大氣環境中無法被檢測的問題，提供一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的方法，并快速精確地定量。

本發明運用定量PCR技術定量研究大氣環境中耐藥基因的含量特征。定量PCR技術是指通過設計目標基因引物，根據標準曲線對目標基因進行定量分析的方法。該方法可同時檢測環境中不可培養微生物所攜帶的耐藥基因，尤其對大氣環境中含量相對較低的微生物中耐藥基因的檢測具有較好的技術優勢，對深入研究大氣環境中耐藥基因對人類公共健康的環境風險具有重要理論意義。

本發明的技術方案

一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的引物序列，包括正向引物和反向引物，其堿基序列為：

正向引物(SEQ ID NO：1)：GCTACATCCTGCTTGCCTTC；

反向引物(SEQ ID NO：2)：CATAGATCGCCGTGAAGAGG。

一種檢測大氣環境中四環素類耐藥基因tetA的方法，是通過以上設計的正向和反向引物來檢測的，其具體方法為：