[發(fā)明專利]一種檢測大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的方法

在審

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• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111549158A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪慶;郭紹月;王麗濤;楊衛(wèi)華;楊光;鮑玲玲;羅景輝
• 申請（專利權(quán)）人: 河北工程大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津耀達(dá)律師事務(wù)所 12223
• 代理人: 侯力

一種檢測大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的方法。該方法包括：將已知濃度的整合子基因intI1標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)提取DNA，以此DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物對此DNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，并記錄循環(huán)數(shù)；將獲得的循環(huán)數(shù)，根據(jù)定量PCR測定目的基因intI1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；運(yùn)用10倍梯度稀釋法，利用已知濃度模板起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品做出目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；確定大氣環(huán)境樣品中一類整合子基因intI1的循環(huán)數(shù)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因intI1的含量。本發(fā)明提供的目的基因引物序列和方法可以對大氣環(huán)境樣品中一類整合子基因intI1進(jìn)行快速精確定量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測大氣環(huán)境中可移動(dòng)遺傳因子intI1的方法。

背景技術(shù)

抗生素是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)所產(chǎn)生的能夠抑制其它類微生物生長、生存的次級代謝產(chǎn)物，以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物，幾乎所有種類的抗生素都是基于在環(huán)境微生物中自然發(fā)現(xiàn)的抗生素結(jié)構(gòu)，主要用于治療細(xì)菌感染疾病。由此導(dǎo)致的抗生素耐藥細(xì)菌感染增加和抗生素耐藥基因的多環(huán)境傳播，使得世界正面臨著嚴(yán)重的健康威脅。

隨著抗生素在臨床抗感染治療上的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌多重耐藥性形成和廣泛傳播的重要原因。整合子系統(tǒng)具有捕獲和表達(dá)外來耐藥基因盒的能力，細(xì)菌可以通過該系統(tǒng)中的整合酶基因intI1編碼的整合酶不斷的從周圍環(huán)境中捕獲和積累耐藥基因盒，形成巨大的耐藥基因多基因座。整合子可存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可遺動(dòng)基因組件上，在同種或不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行基因的水平轉(zhuǎn)移，且整合子在多重耐藥菌的形成及耐藥基因的水平擴(kuò)散中起重要作用。然而，目前對大氣環(huán)境中的intI1研究較少，intI1可攜帶抗生素抗性基因通過空氣傳播方式進(jìn)入人體，影響人類健康。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決大氣環(huán)境中對不可培養(yǎng)微生物的基因無法進(jìn)行檢測的問題，提供了一種能夠快速精確地檢測大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的方法。

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是一種利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增過程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進(jìn)行精確的定量分析方法。此方法對于檢測環(huán)境大氣中含量較少細(xì)菌所含的基因有較好的效果，因此采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究大氣環(huán)境中整合酶基因intI1對人體健康及環(huán)境的影響具有重要理論和實(shí)踐意義。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種檢測大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的引物序列，包括正向引物和反向引物，其堿基序列為：

正向引物(SEQ ID NO 1)：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；

反向引物(SEQ ID NO 2)：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。

一種檢測大氣環(huán)境中可移動(dòng)遺傳因子——一類整合子基因intI1的方法，具體包括：

(1)將已知濃度的整合子基因intI1的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；提取標(biāo)準(zhǔn)樣品中的DNA，以此提取的DNA為模板，利用以上設(shè)計(jì)的正向引物(SEQ IDNO 1)和反向引物(SEQ ID NO 2)對此DNA進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，并記錄達(dá)到熒光閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)；

所述定量PCR的反應(yīng)體系為25μL：12.5μL濃度為1×的qRT qPCR SuperMix溶液，0.3μL 0.2μM的正向引物，0.3μL 0.2μM的反向引物，10.9μL ddH₂0，1.0μLTemplate DNA。

所述DNA的提取方法為：用MO-BIO PowerSoil DNAIsolation kit試劑盒提取。采用該方法提取DNA能夠在較短時(shí)間內(nèi)純化DNA，并適用于各種困難環(huán)境中的DNA提取，可從含微生物量較少的大氣樣品中提取足夠用的DNA量。其專利技術(shù)可去除百分之百的腐殖質(zhì)和PCR抑制劑。