[發(fā)明專利]一種檢測(cè)大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010510791.8
• 申請(qǐng)日: 2020-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111549158A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪慶;郭紹月;王麗濤;楊衛(wèi)華;楊光;鮑玲玲;羅景輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北工程大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 天津耀達(dá)律師事務(wù)所 12223
• 代理人: 侯力

1.一種檢測(cè)大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，堿基序列為：

正向引物：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；

反向引物：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的目的基因引物序列檢測(cè)大氣環(huán)境中一類整合子基因intI1的方法，其特征在于，包括：

(1)將已知濃度的整合子基因intI1的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；提取標(biāo)準(zhǔn)樣品中的DNA，以此提取的DNA為模板，運(yùn)用權(quán)利要求1中的正向引物和反向引物進(jìn)行PCR定量擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物的循環(huán)數(shù)；

(2)將步驟(1)中PCR定量擴(kuò)增獲得的循環(huán)數(shù)，根據(jù)定量PCR測(cè)定目的基因intI1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；運(yùn)用10倍梯度稀釋法，利用已知濃度模板起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)樣品做出目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的C_T值為縱坐標(biāo)，使標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，10⁸，確保R²0.99，擴(kuò)增效率在90％-110％之間時(shí)為有效曲線；

(3)按照步驟(1)所述方法確定大氣環(huán)境樣品中一類整合子基因intI1的循環(huán)數(shù)，并根據(jù)步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因intI1的含量。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反應(yīng)體系為25μL：12.5μL濃度為1×的qRT qPCR SuperMix溶液，0.3μL 0.2μM的正向引物，0.3μL 0.2μM的反向引物，10.9μL ddH₂0，1.0μL Template DNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述目的基因intI1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法如下：

目的基因intI1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：通過(guò)權(quán)利要求1設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因PCR產(chǎn)物，然后利用膠回收試劑盒獲得目的DNA片段；

將純化后的DNA片段運(yùn)用載體加入到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH5α中，加入不含氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，復(fù)蘇1h后，在含有氨芐的固體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜后，通過(guò)藍(lán)白斑篩選法選取單菌落白斑，加入到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；

用質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒，利用PCR擴(kuò)增定性檢測(cè)質(zhì)粒的有無(wú)，條帶清晰可見(jiàn)，切膠后送樣測(cè)序。