[發明專利]一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 202010510370.5
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111690601A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 王曉宇;李翠云;郭康合;李崴;王岱桑;陳多峰;張萬程
• 申請（專利權）人: 海南優尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 陳月婷

本發明涉及一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，具體包括以下步驟：樣本采集、樣本運輸、樣本交接、樣本檢測、樣本預處理、分離制備、原代培養、傳代、凍存、細胞檢測。本發明具有以下有益效果：細胞增殖分化能力強，雜細胞少，相對純凈，分離培養過程簡單，工作量小，細胞爬出概率高，能夠收獲很大數量的間充質干細胞，滿足大批量生產干細胞制品及臨床應用的需要。

技術領域

本發明涉及細胞制備與再生醫學技術領域，具體是指一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法。

背景技術

干細胞是機體的起源細胞，是一類具有自我復制和多向分化潛能的細胞，可以在體外培養、擴增和定向誘導分化成多種細胞。根據其分化能力不同可以將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，成體干細胞存在于骨髓、脂肪、牙髓、臍帶等組織中，成體干細胞的再生醫學研究是近年來生物醫學領域研究的熱點之一，被廣泛應用于神經系統疾病、骨科疾病、消化系統疾病、婦科疾病及抗衰老領域。

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是干細胞的一個研究分支，屬于中胚層的一類早期未分化的多能干細胞，具有自我更新、自我復制、無限增殖及多向分化潛能等特點，主要存在于結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最為豐富，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。目前,我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質干細胞，用得最多的是骨髓來源的間充質干細胞。但骨髓來源的間充質干細胞存在以下問題：隨著年齡的老化，干細胞數目顯著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制備過程不容易質控；移植給異體可能引起免疫反應；取材時對患者有損傷，患者有骨髓疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質干細胞臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。

人臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSC)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞。從臍帶中分離出的MSC細胞，在細胞含量、增殖能力方面均優于骨髓MSC細胞，且免疫原性比骨髓MSC細胞低。與人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells,hESC)、骨髓間充質干細胞(Adipose derivedmesenchymal stem cells,ADMSC)相比，hUCMSC具有更明顯的優勢：①成本較低，hUCs是醫學廢棄物；②來源豐富，全世界每年都會有數億新生兒出生；③不會給捐獻者造成新的創傷和痛苦；④不涉及倫理問題；⑤hUCMSCs是一種較為原始的干細胞，表達某些hESC的特征標志，具有極強的可塑性；⑥與BMSC和ADMSC相比具有更強的擴增能力；⑦無致瘤活性和低免疫原性；⑧與BMSC相比，不會隨著傳代次數增加和機體年齡增長導致增殖能力和分化能力降低。這些優勢使hUCMSC可能成為一種更具潛力的種子細胞。

目前，從臍帶組織中分離間充質干細胞的方法主要有2種方法，一種是酶消化法，另一種是組織塊貼壁法。酶消化法的經濟成本較高，酶的價格昂貴，通常還需配套的消化設備，消化時間長，且時間不易把控，消化時間不夠，便無法得到足夠數量的細胞，消化時間過久，酶對細胞有一定的損傷與老化，導致細胞貼壁能力與增殖活性不佳。組織塊貼壁法操作簡單，經濟成本低，主要是利用是目前使用較為普遍的一種分離制備臍帶間充質干細胞的方法，但是目前使用的組織貼壁法培養的細胞周期長，通常需要14-20天才能得到數量不多的原代細胞。

發明內容

本發明的目的在于提供一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，具體包括以下步驟：

步驟1)樣本采集：選取來自正常足月分娩的新生兒臍帶，在距臍帶兩端2-3cm處結扎，剪下結扎好的臍帶置于裝有30-50ml儲存液的采集瓶中，并采集產婦外周血2ml用于傳染病檢測；