[發明專利]一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 202010510370.5
• 申請日: 2020-06-08
• 公開（公告）號: CN111690601A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 王曉宇;李翠云;郭康合;李崴;王岱桑;陳多峰;張萬程
• 申請（專利權）人: 海南優尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 陳月婷

1.一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

步驟1)樣本采集：選取來自正常足月分娩的新生兒臍帶，在距臍帶兩端2-3cm處結扎，剪下結扎好的臍帶置于裝有30-50ml儲存液的采集瓶中，并采集產婦外周血2ml用于傳染病檢測；

步驟2)樣本運輸：將采集瓶置于4-8℃條件保存，12-48小時內運送至實驗室處理；

步驟3)樣本交接：樣本接收人員收到樣本后檢查樣本有無異常，登記相關信息；

步驟4)樣本檢測：對母血進行傳染病檢測，無異常情況下交接給實驗室制備人員；

步驟5)樣本預處理：從采集瓶中取出新鮮的臍帶，把臍帶放入100mm培養皿中，用75％酒精浸泡2-5min，再用生理鹽水清洗2-5遍，洗干凈表面血漬；用手術剪把臍帶剪成1.0-2.5cm的小段，用生理鹽水清洗每一小段的臍帶，清洗3-5次，洗凈小段臍帶血管內的血液；

步驟6)分離制備：用眼科剪沿靜脈內腔縱向剪開清洗后的小段臍帶，剝離靜脈內膜，繼而將覆蓋動脈的華通氏膠表面略微撕開，而后抽出兩根動脈，將華通氏膠撕下，去除臍帶外層羊膜；將分離好的華通氏膠用眼科彎剪挑起剪10-30min，剪成0.8-1.2mm³大小的組織碎塊；

步驟7)原代培養：預先在100mm的培養皿中加入無血清完全培養基，將剪好的組織碎塊加入培養皿中，搖晃培養皿，用秤量勺輔助使組織塊均勻分散在培養皿中，將培養皿放入CO₂濃度5％，溫度37℃的培養箱中培養；根據細胞爬出情況，培養6-8天后進行無血清完全培養基全量換液；

步驟8)傳代：待細胞爬出融合度達到30％進行傳代，去除培養皿中的組織，加入3-8ml的生理鹽水清洗1-3次，以徹底去除殘留的組織塊；再加入1-3ml的干細胞溫和酶，使干細胞溫和酶沒過培養皿的底部，放在倒置顯微鏡下觀察細胞，細胞開始變圓之后拍打培養皿，使得細胞懸浮分散開；加入五倍體積生理鹽水中和消化，再收集細胞懸液1200-1700rpm離心3-8min，棄上清液，接種至含20-25ml無血清完全培養基的150mm培養皿中，放入CO₂濃度5％，溫度37℃培養箱中培養；

步驟9)凍存：待細胞增殖融合度達到85-95％進行收獲凍存，收集培養上清液，加入8-15ml的生理鹽水清洗1-3次，以徹底去除殘留的組織塊；再加入2-6ml的干細胞溫和消化酶，使酶沒過培養皿的底部，放在倒置顯微鏡下觀察細胞，細胞開始變圓了之后輕輕拍打培養皿，使得細胞懸浮分散開；加入五倍體積培養上清液中和消化，再收集細胞懸液混勻后取樣計數，細胞懸液1200-1700rpm離心3-8min，棄上清液，根據細胞數目加入干細胞凍存液重懸細胞，混勻后按每管(0.8-1.2)x10⁷cells/ml的細胞密度分裝細胞至做好標記的2ml凍存管內，置于-80℃保存，12-24h后置于液氮長期儲存；

步驟10)細胞檢測：待細胞增殖融合度達到85-95％進行收獲，采用血球計數板進行人工計數，利用臺盼藍染色測定活性，細胞流式檢測表面標志物。

2.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，其特征在于：所述的步驟1)中臍帶兩端要進行結扎處理，采集產婦外周血進行乙肝表面抗原、丙肝抗體、艾滋抗體、梅毒螺旋體抗體免疫4項傳染病檢測。

3.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，其特征在于：所述步驟2)中的儲存液為0.9％的內含慶大霉素100單位/ml生理鹽水。

4.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞制劑的制備方法，其特征在于：所述步驟8)中的干細胞凍存液中不含二甲基亞砜，其成分為多種氨基酸、羥乙基淀粉和甘油。