[發明專利]新殼聚糖酶CHI2、其編碼基因及其應用

有效

• 申請號: 202010493312.6
• 申請日: 2020-06-03
• 公開（公告）號: CN111705048B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 程凡升
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;A01N63/50;A01P3/00;C12N1/06;C12R1/19
• 代理公司: 青島鼎丞智佳知識產權代理事務所(普通合伙) 37277
• 代理人: 韓耀朋

本發明公開了新殼聚糖酶CHI2、其編碼基因及其應用，所述新殼聚糖酶具有如Seq ID No:1或具有與Seq ID No:1所示的氨基酸序列至少95％的序列同一性且具有基本相同酶活的氨基酸序列所示的氨基酸序列，屬于殼聚糖酶GH8家族。所述新型殼聚糖酶來源于海鮮市場污泥宏基因組。上述新型殼聚糖酶的編碼基因，該編碼基因具有如Seq ID No:2所示的核苷酸序列。生產上述新型殼聚糖酶的方法包括以下步驟：在適合所述新型殼聚糖酶生產的條件下，對上述能表達新型殼聚糖酶的培養物進行發酵，并對發酵產物進行分離和純化，得到殼聚糖酶。本發明提供的新型殼聚糖酶的活性高、穩定性高，可通過工程菌發酵進行該酶的大批量生產，以便于將該殼聚糖酶應用于工業化寡聚糖生產中。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種新殼聚糖酶CHI2、其編碼基因及其應用。

背景技術

殼聚糖(chitosan)，又名甲殼胺、脫乙酰甲殼素等，化學名稱為β-(1,4)-2- 氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，它是一種由幾丁質脫乙?；玫降奶烊桓叻肿踊衔?，由氨基葡萄糖或少量乙酰氨基葡萄糖殘基通過β-(1,4)-糖苷鍵連接而成，相對分子質量從幾十萬至幾百萬不等，分子式為(C6H11NO4)n。甲殼素的主要來源是節肢動物的表皮和軟體動物的殼，也存在于真菌、細菌、低等藻類的細胞壁中。幾丁質還是除蛋白質外含氮量最高的有機再生資源，其儲量的豐富程度僅次于纖維素。但是由于甲殼素分子量大、不溶于水而不能被有效開發利用，造成了巨大的資源浪費。

殼寡糖(oligochitosan)是殼聚糖經過物理、化學降解或酶法降解生成的聚合度為2-20的低聚糖，由乙酰氨基葡萄糖或者氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。與殼聚糖相比，殼寡糖分子量低，作為一種功能性低聚糖在醫藥、食品、化妝品和農業等領域有著非常廣泛的應用。在醫藥方面，如：降低膽固醇、抗腫瘤、降血壓、治療燒、燙傷、止血、免疫調節、調節腸道菌群等；在食品應用方面，如：抑菌作用，直接作為保健食品、功能性食品添加劑、食品保鮮劑和防腐劑等；在化妝品應用方面，如：具有保濕性、消除人體氧負離子自由基、延緩衰老等功能；在農業方面，如：含氮高的氮肥、活化植物細胞、誘導植物內產生植物防御素、提高植物的抗病能力，還能抑制病源微生物的生長，增強植物的廣譜抗病能力。

由于殼聚糖的許多獨特功能只有被降解為殼寡糖才會顯現出來。因此，選擇高效降解殼聚糖的方法十分關鍵。目前，甲殼低聚糖和殼低聚糖的制備大致分為化學法、生物法和物理法。由于物理法、化學法在生產過程中會產生大量廢水、廢物，還會消耗大量水資源，不符合國家節能減排的政策針。從環保、節能、高效的角度出發，生物酶法降解殼聚糖制備殼寡糖具有物理法和化學法無法比擬的優點酶法降解條件溫和，且水解過程和產物分布容易控制，無污染，已經成為人們研究的熱點。

殼聚糖酶的來源廣泛，在細菌、真菌、藍細菌、病毒和植物中都有發現，并且研究者們相繼從多種微生物中分離得到殼聚糖酶，如WangS，ChaoC等人于2009年篩選出的Bacillus cereus TKU006產幾丁質酶活力僅為0.14U/mL，夏祥在《產殼聚糖酶/甲殼素酶菌株的選育、發酵及殼聚糖酶分離純化與酶學性質研究》中利用透明圈法從污水處理廠廢水中篩選出活力最高的菌株 Bacillus cereus HMX-21，其活力僅為0.56U/mL，WangS,TsengW等于2011年篩選出的產殼聚糖酶菌株Acinetobacter calcoaceticus TKU024，粗酶液最大活力為0.39U/mL。胡遠亮等《產殼聚糖酶菌株的篩選與鑒定》公開了一種從土壤樣品中篩選出的酶活力最高的一株Mitsraria，其酶活力僅為0.729μ/mL。

由于常規的菌株篩選不僅工作量極大，并且該方法會漏掉大量的基因信息，難以獲得新穎度高的殼聚糖酶基因，而宏基因組方法，從新的角度更全面的進行基因篩選，有望獲得新穎的、活力更高的殼聚糖酶，基于宏基因組的文庫篩選可以避免常規方法的不足，有利于挖掘新基因和產生新的蛋白質。

發明內容