[發(fā)明專利]一種丁酸梭菌的快速篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010491356.5
• 申請(qǐng)日: 2020-06-02
• 公開（公告）號(hào): CN111471740A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 婁百勇;呂向云;劉娟;李冰;韓鵬軍;楊永;曹華偉;遠(yuǎn)萬里
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 駐馬店華中正大有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12R1/145
• 代理公司: 北京勁創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

本發(fā)明涉及一種丁酸梭菌的快速篩選方法，屬于微生物領(lǐng)域，包括以下步驟：取待篩選的丁酸梭菌菌株，經(jīng)活化、平板分離初篩、孔板復(fù)篩、試管斜面培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)，得到高產(chǎn)丁酸的丁酸梭菌；所述的平板分離初篩培養(yǎng)基中添加有溴甲酚綠。本發(fā)明的篩選方法增加了固體平板菌落篩選，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的形態(tài)變化，提高了平板挑選菌落的目的性；用孔板代替搖瓶，單次篩選量增加，同時(shí)孔板效價(jià)檢測利用酶標(biāo)儀，單次檢測量成倍提升，大大的提高了篩選效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種丁酸梭菌的快速篩選方法。

背景技術(shù)

菌種是發(fā)酵的根本，每一發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)水平跨越式提高都與菌種技術(shù)進(jìn)步密不可分。因而提高丁酸發(fā)酵的工業(yè)生產(chǎn)水平，對(duì)丁酸工業(yè)產(chǎn)生菌進(jìn)行選育，獲得高產(chǎn)、遺傳穩(wěn)定的菌株，始終是丁酸研究工作中的一個(gè)熱點(diǎn)，其中菌種篩選技術(shù)是獲得高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵。

目前丁酸生產(chǎn)主要以合成法為主，關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的高產(chǎn)菌種的獲得，文章和專利可見的研究較少。發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸的高產(chǎn)菌種的常規(guī)篩選程序包括突變體文庫構(gòu)建，平板分離初步篩選，搖瓶發(fā)酵篩選和HPLC定量鑒定。常規(guī)篩選方法具有以下缺點(diǎn)：首先，傳統(tǒng)的平板分離初步篩選是在普通的平板培養(yǎng)基下，平板上只是長出單菌落，但是單菌落的好壞未知，需要后續(xù)通過搖瓶考察其效價(jià)的高低來確定，篩選效率不高且操作較為繁瑣；其次，搖瓶培養(yǎng)過程對(duì)于物料和人工的消耗都較大；再次，HPLC的高成本和低效率進(jìn)一步限制了高通量篩選目標(biāo)的達(dá)成。盡管還有許多其他檢測丁酸的分析方法，但所有方法都是費(fèi)時(shí)或高成本的，導(dǎo)致無法有效、經(jīng)濟(jì)地檢測丁酸。因此，迫切需要開發(fā)一種簡單，快速，低成本的高通量篩選方法來篩選具有良好性能的丁酸菌。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種丁酸梭菌的快速篩選方法。本發(fā)明提供的篩選方法，提高了平板挑選菌落的目的性，可以大大的提高具有一定生產(chǎn)水平的丁酸梭菌菌株的篩選效率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種篩選丁酸梭菌的平板分離初篩培養(yǎng)基，包括以下質(zhì)量百分含量的組分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、NaCl2％-7％、溴甲酚綠0.5％-0.7％、瓊脂1.3％-1.6％和余量的水。

本發(fā)明提供了一種篩選丁酸梭菌的平板分離初篩方法，包括以下步驟：

將活化后的丁酸梭菌菌株種子液涂布于上述的平板分離初篩培養(yǎng)基中，于35℃-37℃厭氧培養(yǎng)24-48h，測量平板分離初篩培養(yǎng)基上單菌落產(chǎn)生的變色圈直徑，變色圈直徑≥0.5cm且分離度好的單菌落即為初篩合格的丁酸梭菌。

本發(fā)明還提供了一種丁酸梭菌的快速篩選方法，包括以下步驟：

(1)將上述初篩合格的丁酸梭菌進(jìn)行孔板復(fù)篩得到丁酸梭菌的種子液，檢測所得種子液的丁酸含量；

(2)選取步驟(1)中丁酸含量較原始初篩合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作為復(fù)篩優(yōu)株進(jìn)行試管斜面培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)，檢測搖瓶培養(yǎng)后所得種子液的丁酸含量；搖瓶培養(yǎng)后所得種子液中較復(fù)篩優(yōu)株丁酸含量提升≥5％的菌株即為篩選得到的丁酸梭菌。

優(yōu)選的，所述孔板復(fù)篩包括96孔板厭氧培養(yǎng)和48孔板厭氧培養(yǎng)；所述96孔板厭氧培養(yǎng)時(shí)間為12-17h；所述48孔板厭氧培養(yǎng)時(shí)間為24-48h。

優(yōu)選的，所述試管斜面培養(yǎng)為厭氧培養(yǎng)；所述厭氧培養(yǎng)的溫度為35℃-37℃，所述厭氧培養(yǎng)的時(shí)間為24-48h。

優(yōu)選的，所述試管斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以水為溶劑，包括以下組分：蛋白胨8-12g/L、酵母浸粉8-12g/L、葡萄糖0.5-1g/L、NaCl2-7g/L、瓊脂1.3-1.6g/L。

優(yōu)選的，所述搖瓶培養(yǎng)包括搖瓶液體種子培養(yǎng)和搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)；所述搖瓶培養(yǎng)的溫度為35℃-37℃。