[發(fā)明專利]一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010486589.6
• 申請(qǐng)日: 2020-06-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111574612B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃金維;羅四通;羅廣生;鄧小蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東宏遠(yuǎn)集團(tuán)藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/475
• 分類號(hào): C07K14/475;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C12P21/06
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

本發(fā)明涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括以下步驟：S1.乳豬肝預(yù)處理；S2.酶解處理：將步驟S1得到的乳豬肝勻漿加蒸餾水配置成底物，調(diào)節(jié)pH值，水浴加熱，然后加入沉淀劑和中性蛋白酶，得酶解液；S3.滅活、離心；S4.將步驟S3得到的離心液先經(jīng)過(guò)截留分子量為100kDa的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再用截留分子量為6～10kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液減壓濃縮，得促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。本發(fā)明提供一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，操作簡(jiǎn)單、條件溫和，成本低廉、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素產(chǎn)量高、活性佳、耗時(shí)短、工作效率高、且適于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法。

背景技術(shù)

促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(pHGF,Hepatocyte Growth-promoting Factor)，是一種從胎肝或再生肝中發(fā)現(xiàn)和分離的肝源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，為小分子多肽與氨基酸的混合物。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素能特異性促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，減輕肝細(xì)胞壞死，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，降低膽紅素及羧甲基纖維素鈉含量，抗肝纖維化，活躍肝細(xì)胞生物氧化功能和蛋白質(zhì)合成作用，同時(shí)可改善肝臟微循環(huán)，臨床上應(yīng)用于各種重型病毒性肝炎(急性、亞急性、慢性重癥肝炎的早期或中期)的輔助治療。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素具有年齡依耐性，器官特異性，無(wú)種屬特異性，還具有耐熱，易溶的特點(diǎn)。

目前促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法主要為反復(fù)凍融法和酸水解法，以新鮮乳豬或乳牛肝臟為原料，其中采用反復(fù)凍融法時(shí)，反復(fù)冷凍與融化細(xì)胞中形成的冰晶及剩余液體中鹽濃度的增高可以使細(xì)胞破裂，釋放出蛋白質(zhì)，并降解為多肽，再通過(guò)超濾除去大分子物質(zhì)，真空低溫濃縮，得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素液，雖然制備的多肽活性較高，但是反復(fù)凍融法耗時(shí)長(zhǎng)，工作效率低，制備得到的多肽收率低；其中采用酸水解法時(shí)，用鹽酸調(diào)pH值為(3.2±02)，于-25℃冷凍，通過(guò)水浴解凍，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，再水浴加熱，冷卻，離心沉淀，上清液進(jìn)行超濾，得促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素液，雖然酸水解法成本較低，制備的多肽收率高，但是多肽的活性較低。

因此，亟需一種成本低廉、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素產(chǎn)量高、活性佳、工作效率高、耗時(shí)短且適于工業(yè)化生產(chǎn)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，操作簡(jiǎn)單、條件溫和，具有成本低廉、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素產(chǎn)量高、活性佳、工作效率高、耗時(shí)短且適于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括以下步驟：

S1.乳豬肝預(yù)處理：取乳豬肝臟，去筋膜、結(jié)締組織，用水洗凈，切成2～5cm小塊，稱重，按1:(0.5～3)(W/V)加入純化水，置于高速組織勻漿機(jī)中攪拌成粒徑為0.5～2mm的乳豬肝勻漿；

S2.酶解處理：將步驟S1得到的乳豬肝勻漿加蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為1～9％的底物，調(diào)節(jié)底物的pH值，水浴加熱，然后加入沉淀劑和1000～5000U/g中性蛋白酶，在40～60℃溫度下恒溫磁力攪拌酶解，得酶解液；

S3.滅活、離心：將步驟S2得到的酶解液在70～100℃水浴保溫，然后冷卻至室溫，再進(jìn)行離心得離心液；

S4.將步驟S3得到的離心液先經(jīng)過(guò)截留分子量為100kDa的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再用截留分子量為6～10kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，濾液減壓濃縮，即得促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。

優(yōu)選地，所述沉淀劑包括L-巖藻糖和羧甲基纖維素鈉。

更優(yōu)選地，所述L-巖藻糖和羧甲基纖維素鈉的質(zhì)量比為(2～3.5):1。

優(yōu)選地，所述步驟S2中用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)底物的pH值為6～8。