[發明專利]耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針、試劑盒和應用

有效

• 申請號: 202010484890.3
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN112226523B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 羅娜;欒春光;涂京霞;孫義玄;曹偉華;劉靜;郝建秦;王德良
• 申請（專利權）人: 廣州南沙珠江啤酒有限公司;中國食品發酵工業研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/225
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李德魁

本發明提供一種耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針、試劑盒和應用，涉及啤酒有害菌檢測技術領域。本發明的耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針，所述探針針對SEQ ID No.1所示序列設計。本發明的試劑盒包括上述特異性檢測探針。本發明的特異性檢測探針或試劑盒用于檢測啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌，具有特異性強、準確性高、靈敏度高等優點。

技術領域

本發明涉及啤酒有害菌檢測領域，特別是涉及一種耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針、試劑盒和應用。

背景技術

啤酒具有特有的理化性質，當處于低溫缺氧環境、pH值較低、含有苦味物質、微生物生長所需的營養物質含量少等環境下，具有抵抗一般微生物侵襲的作用。盡管如此，啤酒廠環境中仍生存著一些耐酸、耐酒花苦味物質和專性厭氧的微生物，它們利用酵母的中間代謝產物和酵母自溶物，給啤酒生產帶來危害。

目前，啤酒廠中的啤酒腐敗菌通常為厭氧或兼性厭氧的微生物，主要包括乳酸桿菌屬 (Lactobacillus sp)、果膠桿菌屬(Pectinatus sp)、巨球菌屬(Megasphaera sp)、片球菌屬 (Pediococcus sp)、發酵單胞菌屬(Zymomonas sp)和微球菌屬((Micrococcus sp)等。乳酸菌是引起啤酒腐敗最常見的微生物，約90％的啤酒污染是由乳酸菌引起的。大部分乳酸菌屬革蘭氏陽性兼性厭氧球菌和革蘭氏陽性無芽抱桿菌，在有氧和無氧條件下均能生長，且適合在酸性環境下生長。乳酸菌對啤酒花有一定的抗性，會引起啤酒酸度下降、風味變差，更為嚴重是還會影響啤酒酵母的生長，使啤酒發酵無法正常進行。

耐乙酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)是2012年，由廣州珠江啤酒股份有限從腐敗啤酒中新發現的一類腐敗菌，該類菌最早在米醋發酵液中被發現過，但是在啤酒被發現尚屬首次，國內暫時還未發現有成熟的檢測研究方法和檢測手段，更沒有可以對該菌進行特異性檢測的試劑盒。由于該菌對產品質量造成不良影響，研究該菌的菌株特性及開發其特異性檢測試劑盒對啤酒釀造行業的食品安全具有十分重要意義。我們研究發現，該菌為革蘭氏陽性菌，不產生孢子，大小0.4～0.5×1.1～3.4μm，單個、成對或短鏈，暗視場強折光，不運動，一般可以承受4％-5％的醋酸含量，屬于兼性厭氧菌，同型發酵型，過氧化氫酶陰性，氧化酶陰性。該菌可在苦味值≤5Bu啤酒中生長，能使啤酒變渾濁，屬于啤酒的二次污染菌。該菌生長緩慢，在NBB培養基上生長14天以上才肉眼可見，其適宜在pH3.3～6.6，23-40℃下生長，低于15℃不生長。由于耐乙酸乳桿菌生長緩慢、難培養的特性，其在啤酒中潛伏期較長，不易被發現，如果發現不及時，可能導致酒體被嚴重污染，造成嚴重的后果。因此，行業內亟需建立一種對耐乙酸乳桿菌的快速檢測技術。

目前，檢測啤酒腐敗菌的方法分為傳統培養法和分子鑒定法，傳統培養法包括培養基檢測法、生化微量管發酵法等，分子鑒定法包括16SrDNA分子測序、普通PCR法、Real-time PCR 法、PCR-ELISA等。針對上述難培養啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌的PCR特異檢測探針和試劑盒的檢測效率和檢測靈敏度也有待提高。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針，用于檢測啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌，具有特異性強、檢測周期短、檢測限低、靈敏度極高的優點。

一種耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針，所述探針針對SEQ ID No.1所示序列設計。

本發明的探針是針對SEQ ID No.1所示序列設計，對應AP014808.1:1564884-1565303，保守假定蛋白，該序列具有高度保守性，針對該序列設計的特異性檢測探針YW1，能精確、快速、準確地檢測啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌，對于陽性單菌樣品和混合菌均表現出極其特異的陽性檢測結果。

在其中一個實施例中，所述耐乙酸乳桿菌特異性檢測探針的引物序列如下所示：

F：5’-CCAGCCTTCAAGGTGGTTGTCT-3’(SEQ ID No.2)，