[發明專利]超高效液相色譜串聯質譜技術血清中抗焦慮和催眠藥物的試劑盒

有效

• 申請號: 202010484196.1
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN111679002B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 成曉亮;李美娟
• 申請（專利權）人: 南京品生醫療科技有限公司;南京品生醫學檢驗實驗室有限公司;福州品生醫療科技有限公司;武漢品生醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/72
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

1.一種試劑盒在利用超高效液相色譜串聯質譜技術檢測血清中抗焦慮和催眠藥物中的應用，

所述抗焦慮和催眠藥物分別為：硝西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、替馬西泮、阿普唑侖、溴西泮、勞拉西泮、咪達唑侖、佐匹克隆、地西泮和唑吡坦；

所述的試劑盒包含如下試劑：

（1）洗脫液：

洗脫液A：0.05%乙酸-0.1mM乙酸銨水溶液；洗脫液B：乙腈；

（2）校準品溶液：

將上述抗焦慮和催眠藥物配制成如下濃度的標準品母液：硝西泮1mg/mL、奧沙西泮1mg/mL、艾司唑侖1mg/mL、替馬西泮1mg/mL、阿普唑侖?0.1mg/mL、溴西泮1mg/mL、勞拉西泮1mg/mL、咪達唑侖1mg/mL、佐匹克隆5mg/mL、地西泮1mg/mL和唑吡坦0.1mg/mL；

分別移取各標準品母液：硝西泮20μL、奧沙西泮50μL、艾司唑侖20μL、替馬西泮40μL、阿普唑侖50μL、溴西泮20μL、勞拉西泮10μL、咪達唑侖5μL、佐匹克隆4μL、地西泮100μL和唑吡坦100μL，再加入至581μL甲醇中得到1mL混合標準儲備溶液；將上述混合標準儲備溶液以不含抗焦慮和催眠目標藥物的空白血清配制成七個不同濃度點的校準品溶液；所述校準品溶液的七個濃度點為：

阿普唑侖和咪達唑侖的濃度相同，其七個濃度點為依次為：0.5ng/mL、?1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL；

勞拉西泮和唑吡坦的濃度相同，其七個濃度點為依次為：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500?ng/mL；

硝西泮、艾司唑侖、溴西泮和佐匹克隆的濃度相同，其七個濃度點為依次為：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500?ng/mL、1000ng/mL；

替馬西泮的七個濃度點為依次為：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000?ng/mL；

奧沙西泮的七個濃度點為依次為：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250?ng/mL、2500ng/mL；

地西泮的七個濃度點為依次為：10?ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000?ng/mL；

（3）混合內標溶液：

以甲醇配制如下同位素內標母液：硝西泮-d5?0.1mg/mL、奧沙西泮-13C6?1mg/mL、艾司唑侖-d5?0.1mg/mL、替馬西泮-d5?1mg/mL、阿普唑侖-d5?0.01mg/mL、溴西泮-d4?0.1mg/mL、勞拉西泮-d4?0.1mg/mL、咪達唑侖-d7?0.1mg/mL、佐匹克隆-d8?0.1mg/mL、地西泮-d50.1mg/mL和唑吡坦-d8?1mg/mL；

分別移取各同位素內標母液：硝西泮-d5?5μL、奧沙西泮-13C6?1μL、艾司唑侖-d5?5μL、替馬西泮-d5?1μL、阿普唑侖-d5?50μL、溴西泮-d4?5μL、勞拉西泮-d4?2μL、咪達唑侖-d7?1μL、佐匹克隆-d8?5μL、地西泮-d5?20μL和唑吡坦-d8?2μL，再加入至903μL甲醇中得到1mL混合內標溶液；

（4）蛋白質沉淀劑：

甲醇與異丙醇的體積比1:4；

（5）質控品：

取上述混合標準儲備溶液以不含抗焦慮和催眠目標藥物的空白血清配制成三個不同濃度L-QC、M-QC、H-QC，其中，

L-QC中包含：硝西泮4mg/mL、奧沙西泮10mg/mL、艾司唑侖4mg/mL、替馬西泮8mg/mL、阿普唑侖1mg/mL、溴西泮4mg/mL、勞拉西泮2mg/mL、咪達唑侖1mg/mL、佐匹克隆4mg/mL、地西泮20mg/mL和唑吡坦2mg/mL；

M-QC中包含：硝西泮40mg/mL、奧沙西泮100mg/mL、艾司唑侖40mg/mL、替馬西泮80mg/mL、阿普唑侖10mg/mL、溴西泮40mg/mL、勞拉西泮20mg/mL、咪達唑侖10mg/mL、佐匹克隆40mg/mL、地西泮200mg/mL和唑吡坦20mg/mL；

H-QC中包含：硝西泮400mg/mL、奧沙西泮1000mg/mL、艾司唑侖400mg/mL、替馬西泮800mg/mL、阿普唑侖100mg/mL、溴西泮400mg/mL、勞拉西泮200mg/mL、咪達唑侖100mg/mL、佐匹克隆400mg/mL、地西泮2000mg/mL和唑吡坦200mg/mL；

所述應用它包括如下步驟：采用超高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過預處理的血清中的上述抗焦慮和催眠藥物，先利用超高效液相色譜將目標待測物與血清基質中的干擾組分進行分離，再利用質譜同位素內標定量法，以標準品與內標物的濃度比為X軸，標準品與內標物的峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算血清中抗焦慮和催眠藥物的含量，具體色譜條件為：

（1）超高效液相色譜條件：

色譜柱型號：ACQUITY?UPLC?CSH?C18?2.1×50?mm，1.7?μm；

采用流動相A和流動相B為混合流動相進行梯度洗脫，所述流動相A和流動相B的初始比例為90:10；所述梯度洗脫過程如下：在0.0-1.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由90:10勻速漸變至35:65；在1.0-3.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由35:65勻速漸變至2:98；在3.0-5.0分鐘內，流動相A和流動相B的體積比由2:98勻速漸變至90:10；每個樣品采集時間為5.0?分鐘；

（2）質譜條件：

在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式，毛細管電壓為2.5kVESI+；?源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為500℃，脫溶劑氣流速為800?L/h，錐孔氣流速為150?L/h；同時監測了各目標物及其對應同位素內標；

經過預處理的血清按照如下方法制備：取50?μL血清于1.5?mL離心管中，向其中加入200?μL含內標的蛋白沉淀劑，振蕩5?min，在14000?r/min，4℃離心5min后，轉移離心管中的上清液60?μL至塑料內襯管中，待進樣，進樣量1?μL；

校準品的前處理按照如下方法制備：每個濃度點樣品取50?μL于1.5?mL離心管中，向其中加入200?μL含內標的蛋白沉淀劑，振蕩5?min，在14000?r/min，4℃離心5min后，轉移離心管中的上清液60?μL至塑料內襯管中，待進樣，進樣量1?μL；

質控品的前處理按照如下方法制備：分別取質控品溶液L-QC、M-QC和H-QC，各50?μL于1.5?mL離心管中，向其中加入200?μL含內標的蛋白沉淀劑，振蕩5?min，在14000?r/min，4℃離心5min后，轉移離心管中的上清液60?μL至塑料內襯管中，待進樣，進樣量1?μL；

其中：含內標的蛋白沉淀劑是由混合內標溶液與蛋白沉淀劑混合配制而成，混合內標溶液與蛋白沉淀劑的體積比為1:99。