[發(fā)明專利]小麥TaRDR6基因及其在雄性不育中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010483740.0
• 申請日: 2020-06-01
• 公開（公告）號: CN111534522B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張榮志;李根英;李玉蓮;宋國琦;張淑娟;李瑋;李吉虎;高潔;谷田田
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/65;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 濟(jì)南誠智商標(biāo)專利事務(wù)所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

本發(fā)明公開了小麥TaRDR6基因及其在雄性不育中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過將構(gòu)建的具有敲除TaRDR6基因功能的表達(dá)載體pBUE411?RDR6轉(zhuǎn)入小麥內(nèi)，沉默小麥中TaRDR6基因的表達(dá)，可以獲得花粉敗育的小麥植株。通過一個基因轉(zhuǎn)化過程，就可實(shí)現(xiàn)基因組水平RDR6基因的沉默，是利用基因工程技術(shù)沉默RDR6基因的有力工具。沉默該基因可以幫助研究人員進(jìn)一步了解小麥中RDR6在phasiRNA合成路徑中是如何具體發(fā)揮作用和行使其生物學(xué)功能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及小麥TaRDR6基因及其在雄性不育中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在古細(xì)菌和細(xì)菌原核生物中，CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)/(CRISPR-associated 9)系統(tǒng)是用來對抗外源的DNA如入侵的病毒等的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由sgRNA(small guide RNA)和Cas9核酸酶兩種元件組成。sgRNA通過堿基互補(bǔ)配對來識別基因組中相對應(yīng)的靶位點(diǎn)序列，從而引導(dǎo)Cas9核酸酶對靶位點(diǎn)序列進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈的斷裂，生物體在通過同源或者非同源重組進(jìn)行DNA修復(fù)，在修復(fù)過程中會引入DNA序列的定點(diǎn)突變。因此，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于疾病的基因治療和農(nóng)作物的基因改良。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，由A、B和D三套基因組組成，這三套基因組的部分同源基因具有很高的部分同源性，這些部分同源基因只有同時發(fā)生突變，才能獲得基因敲除的突變體。因此，在部分同源基因間的保守區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA，可以實(shí)現(xiàn)同時敲除所有部分同源基因。

PhasiRNA主要參與植物的生長發(fā)育、生殖發(fā)育和抗逆反應(yīng)等方面(Deng etal.2018)。具有一定相位的phasiRNA(Phased small-interfering RNAs)，多數(shù)長21-nt或者24-nt。他們是由PHAS基因(phasiRNAproducing genes)或者位點(diǎn)產(chǎn)生的。在小麥幼穗和花藥組織中存在大量的21-nt和24-nt的phasiRNA，在不同發(fā)育時期的雄蕊組織中phasiRNA呈現(xiàn)動態(tài)的表達(dá)，表達(dá)高峰期出現(xiàn)在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的前后(Zhang et al.2020)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供小麥TaRDR6基因及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過將構(gòu)建的具有敲除TaRDR6基因功能的表達(dá)載體pBUE411-RDR6轉(zhuǎn)入小麥內(nèi)，沉默小麥中TaRDR6基因的表達(dá)，可以獲得花粉敗育的小麥植株。

小麥TaRDR6基因，位于第三號染色體的3B和3D上，分別命名為TaRDR6-3B和TaRDR6-3D，所述TaRDR6-3B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TaRDR6-3D的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種利用上述小麥TaRDR6基因構(gòu)建雄性不育的小麥植株的方法，降低或沉默小麥中小麥TaRDR6基因的表達(dá)。

進(jìn)一步的，上述方法中所述降低或沉默小麥中小麥TaRDR6基因的表達(dá)，具體包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)靶向TaRDR6基因的sgRNA；

2)根據(jù)步驟1)獲得的sgRNA設(shè)計(jì)sgRNA的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)利用步驟2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和pBUE411載體構(gòu)建具有敲除小麥TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6雙元載體；

4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將步驟3)獲得的雙元載體轉(zhuǎn)化入植物中，降低或沉默小麥TaRDR6基因的表達(dá)，即可獲得花粉敗育的小麥植株。

進(jìn)一步的，上述方法步驟1)中所述的TaRDR6基因的sgRNA的核苷酸序列SEQ IDNO.3所示。

進(jìn)一步的，上述步驟3)中所述的具有敲除小麥TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6雙元載體，包括表達(dá)盒A和表達(dá)盒B；