[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010481504.5 | 申請日： | 2020-05-31 |
| 公開（公告）號： | CN111499699A | 公開（公告）日： | 2020-08-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李健;張進;鐘芳林;萬雙燕 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳晶蛋生物醫(yī)藥科技有限公司;江西晶美瑞生物醫(yī)藥有限公司;李健;張進;鐘芳林;萬雙燕 |
| 主分類號： | C07K14/165 | 分類號： | C07K14/165;C12N15/70;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 新余市渝星知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 36124 | 代理人： | 廖平 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳市坪山區(qū)坪山*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 新型 冠狀病毒 covid 19 蛋白 表達 純化 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種新型冠狀病毒COVID?19?N蛋白表達和純化的方法，步驟有：構(gòu)建并轉(zhuǎn)化COVID?19?N蛋白表達質(zhì)粒；取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入IPTG誘導培養(yǎng)；培養(yǎng)液離心，重懸，破碎后離心，取上清，選用鎳柱純化；依次用不同咪唑濃度的洗脫液進行洗脫，收集不同咪唑濃度的洗脫液；將純化的COVID?19?N蛋白進行透析。本發(fā)明的有點有：使用Pet?28a載體，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)得到高產(chǎn)量、純度高達98％以上的COVID?19?N蛋白，免疫原性高，穩(wěn)定性好。該制備方法耗費成本低、操作簡單，可重復性高，可投入大量生產(chǎn)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白制備技術(shù)。
背景技術(shù)
新型冠狀病毒(下簡稱新冠病毒)感染肺炎傳播性強、傳染速度快、致死率高，對此新冠病毒檢測以及治療藥物研究顯得尤為重要。
COVID-19-N蛋白是新冠病毒衣殼內(nèi)最重要的蛋白之一，也是含量最豐富的蛋白。COVID-19-N蛋白與病毒基因組RNA相互纏繞形成病毒核衣殼，在病毒RNA的合成過程中發(fā)揮著重要的作用。同時，COVID-19-N蛋白在新冠病毒中相對保守，在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，感染早期機體就能產(chǎn)生抗COVID-19-N蛋白的高水平抗體。因此，它常作為新冠病毒的診斷檢測工具，是免疫學快速診斷的核心原料，也可以用來進一步制備單抗或開展解析該蛋白結(jié)構(gòu)等研究。然而，市面上制備COVID-19-N蛋白主要采用哺乳動物細胞蛋白表達系統(tǒng)表達，該過程需要耗費大量昂貴的培養(yǎng)基且實驗周期長。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，解決生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長的問題，為免疫學快速診斷、制備單抗、開展解析蛋白結(jié)構(gòu)研究等提供物質(zhì)基礎。
為了達到上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，包括如下步驟：
(1)構(gòu)建COVID-19-N蛋白表達質(zhì)粒；
(2)將COVID-19-N蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；
(3)誘導培養(yǎng)表達COVID-19-N蛋白，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；將全部過夜菌液加到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床上培養(yǎng)直至OD600為0.6-0.8之間，加入IPTG誘導培養(yǎng)；
(4)純化COVID-19-N蛋白，操作包括：將誘導表達后的大腸桿菌培養(yǎng)液離心，收集沉淀物即菌體，重懸在重懸緩沖液中；高壓破碎后離心，取上清，棄掉沉淀；選用鎳柱(1～2ml)進行蛋白純化；鎳柱使用前用50倍柱體積平衡緩沖液對柱子進行平衡；再將離心取得的上清液流過柱子，再依次用不同咪唑濃度的洗脫液進行洗脫，收集不同咪唑濃度的洗脫液；將純化的COVID-19-N蛋白進行透析。
進一步地，所述步驟(3)詳細過程是：取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm的搖床上培養(yǎng)過夜；將全部過夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm的搖床上培養(yǎng)直至OD600為0.6-0.8之間。加入IPTG，使終濃度為1mmol，30℃，200rpm，誘導6h。
進一步地，所述步驟(4)的詳細過程是：
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