[發明專利]一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法

在審

• 申請號: 202010481504.5
• 申請日: 2020-05-31
• 公開（公告）號: CN111499699A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 李健;張進;鐘芳林;萬雙燕
• 申請（專利權）人: 深圳晶蛋生物醫藥科技有限公司;江西晶美瑞生物醫藥有限公司;李健;張進;鐘芳林;萬雙燕
• 主分類號: C07K14/165
• 分類號: C07K14/165;C12N15/70;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12R1/19
• 代理公司: 新余市渝星知識產權代理事務所(普通合伙) 36124
• 代理人: 廖平

1.一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，其特征在于：

包括如下步驟：

(1)構建COVID-19-N蛋白表達質粒；

(2)將COVID-19-N蛋白表達質粒轉化；

(3)誘導培養表達COVID-19-N蛋白，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液體培養基中，培養過夜；將全部過夜菌液加到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液體培養基中，搖床上培養直至OD₆₀₀為0.6-0.8之間，加入IPTG誘導培養；

(4)純化COVID-19-N蛋白，操作包括：將誘導表達后的大腸桿菌培養液離心，收集沉淀物即菌體，重懸在重懸緩沖液中；高壓破碎后離心，取上清，棄掉沉淀；選用鎳柱(1～2ml)進行蛋白純化；鎳柱使用前用50倍柱體積平衡緩沖液對柱子進行平衡；再將離心取得的上清液流過柱子，再依次用不同咪唑濃度的洗脫液進行洗脫，收集不同咪唑濃度的洗脫液；將純化的COVID-19-N蛋白進行透析。

2.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，其特征在于：

所述步驟(3)詳細過程是：取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液體培養基中，在37℃，200rpm的搖床上培養過夜；將全部過夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液體培養基中，在37℃，200rpm的搖床上培養直至OD₆₀₀為0.6-0.8之間；加入IPTG，使終濃度為1mmol，30℃，200rpm，誘導6h。

3.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，其特征在于：

所述步驟(4)的詳細過程是：

將誘導表達后的大腸桿菌培養液以6000rpm的轉速離心15min，收集沉淀物即菌體，稱重為3～5g，以重懸緩沖液：菌重＝10mL:1g的比例重懸在含有100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl，2mmDTT，10mM imidazole的重懸緩沖液中；高壓破碎后以11000rpm的轉速離心35min，取上清，棄掉沉淀；選用鎳柱(1～2ml)進行蛋白純化；鎳柱使用前用50倍柱體積含有100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl，10mM imidazole的平衡緩沖液對柱子進行平衡；再將離心取得的上清液流過柱子，再依次用20倍柱體積含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑濃度的洗脫液進行洗脫，收集不同咪唑濃度的洗脫液；300mM咪唑的洗脫液含有目的蛋白COVID-19-N蛋白，將純化的COVID-19-N蛋白進行透析，透析袋大小為10kDa，溫度為4℃，時間為12h，透析buffer為：100mM Tris HCl pH7.5,300mM NaCl。

4.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，其特征在于：

所述步驟(1)是：將編碼人COVID-19-N蛋白的基因克隆到pET-28a載體中，構建表達質粒，制得COVID-19-N質粒凍干粉。

5.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒COVID-19-N蛋白表達和純化的方法，其特征在于：

所述步驟(2)詳細過程是：將5μg COVID-19-N質粒凍干粉在12000rpm離心5min，加入30μL去離子水，振蕩溶解，12000rpm離心10min；取2μl上清液轉化到Escherichia coli BL21Rosetta(DE3)感受態菌株中，冰浴30min，42℃熱激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液體培養基，37℃，150rpm，搖床培養1h，取30μL培養液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固體培養板上，在溫度為37℃的培養箱中培養過夜；挑選出單一菌落，加入到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液體培養基中，在37℃，200rpm的搖床上培養8小時。