[發明專利]一種能夠得到完整外泌體的免疫磁珠分離方法

在審

• 申請號: 202010480003.5
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111575228A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 曾鵬;張亞楠
• 申請（專利權）人: 上海思路迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京市蘭臺律師事務所 11354
• 代理人: 于越

本發明涉及一種能夠得到完整外泌體的免疫磁珠分離方法，通過使用特定濃度的胰蛋白酶為主體配制分離液針對免疫磁珠和外泌體之間起連接作用的抗體蛋白進行消化并使免疫磁珠和外泌體分離，從而將外泌體從免疫磁珠上分離，同時保持外泌體的完整性以及生物活性，其所包含的內容物如蛋白、核酸等不受破壞，可以進一步用于外泌體形態、生物活性等研究以及TEM、NTA等表征檢測方法。

技術領域

本發明涉及生物實驗技術領域，尤其涉及一種能夠得到完整外泌體的免疫磁珠分離方法。

背景技術

外泌體(Exosome)：是大多數細胞都會分泌的一類直徑在30-150nm的盤狀囊泡，它包含有多種核酸以及蛋白質等物質，可進行細胞間的信息交換。在細胞胞吐形成外泌體時，細胞中的多種蛋白質、脂質、RNA以及一些融合基因等分子會選擇性地進入到這些囊泡中，因此外泌體就攜帶了母細胞來源的諸多生物學信息。另一方面，外泌體具有與細胞相同的膜結構，即磷脂雙分子層，可以很好地保護其攜帶的蛋白、核酸不受外界影響而能夠保持其原本性質。

目前越來越多的研究表明，外泌體內物質與人類多種疾病的發生、發展有著密切的關系。外泌體提取的金標準方法是梯度超速離心法，但該方法耗時長、費人力、實驗設備昂貴不利于研究的開展。免疫磁珠法可以特異性地快速捕獲體液樣本中的外泌體，結合自動化設備可完成外泌體的全自動化提取。

免疫磁珠捕獲外泌體的方法最終所得到的均是外泌體-磁珠復合物，例如國內專利：CN107893051A、CN109738625A、CN106289926A等，這些專利均是利用磁珠捕獲外泌體后得到外泌體-磁珠的復合物，該復合物并不能很好的進行如TEM、NTA等表征檢測，也就無法充分的證明磁珠所捕獲的是外泌體而不是其他囊泡。目前并沒有一種合適的方法在保證外泌體完整性的前提下將外泌體從免疫磁珠上分離下來，現有技術如高濃度鹽溶液、極低pH鹽溶液或強蛋白變性劑均是直接將磁珠上的外泌體進行裂解，從而達到分離，均不能得到結構完整的外泌體。

因此，國內亟需一種既可以簡便快速，又可以保證外泌體完整性的方法將外泌體從免疫磁珠上進行分離。目前現有的外泌體-磁珠分離方法還有提升空間，亟待開發出可保護外泌體完整性的分離方法。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明提出一種能夠得到完整外泌體的免疫磁珠分離方法，通過使用消化效果較溫和可控的胰蛋白酶為主體配制分離液，針對免疫磁珠和外泌體之間起連接作用的抗體蛋白進行消化并使免疫磁珠和外泌體分離，同時避免在消化過程中損壞外泌體結構、破壞外泌體內部蛋白。

為實現以上目的，本發明所采用的技術方案包括：

一種能夠得到完整外泌體的免疫磁珠分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、免疫磁珠-外泌體復合物重懸液中依照1mg免疫磁珠-外泌體復合物對應2～100μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶混勻，得到消化組合物；

S2、將所述消化組合物置于溫度范圍20℃至40℃(可采用恒溫水浴)進行消化反應，持續時間1至10分鐘，得到第一分離組合物；

S3、向所述第一分離組合物內添加等量于胰蛋白酶加入量的胰蛋白酶抑制劑并混合均勻，得到第二分離組合物；

S4、對所述第二分離組合物進行磁分離，所得上清部分即為外泌體溶液。

進一步地，所述免疫磁珠-外泌體復合物重懸液包括采用PBS溶劑的重懸液。

進一步地，所述步驟S1包括依照1mg免疫磁珠-外泌體復合物對應25μg胰蛋白酶的配比加入胰蛋白酶混合，得到消化組合物。

進一步地，所述步驟S2包括將所述消化組合物置于恒溫37℃中進行消化反應，持續時間3分鐘，得到第一分離組合物。