[發(fā)明專利]特異性檢測(cè)TWI型傳染性支氣管炎病毒的反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010474807.4
• 申請(qǐng)日: 2020-05-29
• 公開（公告）號(hào): CN111534642A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張小榮;廖凱;吳艷濤;郭夢(mèng)嬌;陳淑琴;張成成;鄢坤;楚電峰;范根成;杜元釗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué);青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種特異性檢測(cè)TW I型IBV的RT-qPCR引物和探針，其特征在于，選自下述兩套檢測(cè)引物和探針之一，其中第一套檢測(cè)引物和探針包括：上游引物TW I/F1序列為5’-AGAGATGTTGGRGAAGTCACTGTT-3’(SEQ ID NO.8)，下游引物TW I/R1序列為5’-CTCTGGTAGTAGTAAACGTACGTATCATTATC-3’(SEQ ID NO.9)，探針TW I/Probe1序列為5’-CACTATCTAGTGCTACTTTGTAT-3’(SEQ ID NO.10)，所述熒光探針5’和3’端分別標(biāo)記6-FAM基團(tuán)和MGB基團(tuán)；

第二套檢測(cè)引物和探針包括：上游引物TW I/F2序列為5’-CGCTTATGCAGTAGTAAATGTTTCTTCAC-3’(SEQ ID NO.11)，下游引物TW I/R2序列為5’-CCACCGCATACCTTGACCTACA-3’(SEQ ID NO.12)，探針TW I/Probe2序列為5’-CATTAACAACTGTATCACCACT-3’(SEQ ID NO.13)，所述熒光探針5’和3’端分別標(biāo)記6-FAM基團(tuán)和MGB基團(tuán)。

2.一種特異性檢測(cè)TW I型IBV的RT-qPCR試劑盒，其特征在于，試劑盒中含有權(quán)利要求1所述第一套檢測(cè)引物和探針或/和第二套檢測(cè)引物和探針。

3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含陽性標(biāo)準(zhǔn)品，所述的陽性標(biāo)準(zhǔn)品是含有TW I型IBV S1基因片段的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒是用引物TWI-S1F和TWI-S1R引物對(duì)從TW I型IBV毒株CK/CH/AH/2011/3基因組cDNA擴(kuò)增出的包含完整S1基因的DNA片段連接到pEasyT3載體上得到的，所述引物TWI-S1F序列為5’-CTGCACGCAAATTATATATTTTGG-3’(SEQ IDNO.14)，所述引物TWI-S1R序列為5’-GTATGTACTCATCTGTAACAGT-3’(SEQ ID NO.15)，擴(kuò)增目的片段大小為2kb。

4.如權(quán)利要求2或3所述試劑盒的使用方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)提取病毒樣本的總RNA；

(2)反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒從10⁹拷貝/μl到10¹拷貝/μl系列稀釋作為模板，以權(quán)利要求1中所述的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)以步驟(2)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以權(quán)利要求1中所述的引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

(5)PCR反應(yīng)過程中自動(dòng)檢測(cè)、采集熒光信號(hào)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待檢樣本中的病毒含量進(jìn)行定量。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20μl，20μl體系里含有10μl、2×qPCR Probe Master Mix、0.4μl上游引物、0.4μl下游引物、0.2μl探針、2μl模板cDNA和7μl無菌水。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40個(gè)循環(huán)。