[發(fā)明專利]一種內切葡聚糖苷酶突變體、基因、工程菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010471544.1
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111690629B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設計）人: 柳志強;周海巖;易曉男;周建寶;薛亞平;鄭裕國;陳德水;程新平;李勉;王紅艷;陳凱茜
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學;浙江華康藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開一種內切葡聚糖苷酶突變體、基因工程菌及其在降解纖維素中的應用。所述內切葡聚糖苷酶突變體是將SEQ ID No.3所示氨基酸序列第202位的賴氨酸突變?yōu)榫彼帷１景l(fā)明內切葡聚糖苷酶突變體的比活力比野生酶顯著提高1.4倍左右。以微晶纖維素為底物時，纖維素酶與突變酶的共同反應，反應催化效率較以纖維素酶單獨降解底物顯著提高了23.5％，可以看出突變酶顯著提高了酶活力，可以降低工業(yè)應用的經濟成本，為其在食品生物乙醇等工業(yè)生產領域提供了應用基礎。

(一)技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種采用定點突變方法制備內切葡聚糖苷酶突變體及其應用。

(二)背景技術

面對石化能源稀缺和環(huán)境污染帶來的雙重壓力，尋找可再生的清潔能源成為各國科研人員關注的焦點。其中木質纖維素具有來源廣泛、價格低廉、再生性強等優(yōu)點，是地球上最豐富的可再生資源，全球每年通過光合作用產生的植物約億噸，為避免與人爭糧，木質纖維素將成為生物乙醇生產最具潛力的原料。

利用纖維素酶轉化木質纖維素生物質，對解決能源危機和環(huán)境污染問題具有重要的戰(zhàn)略意義。自然界中存在三種協(xié)同降解纖維素的酶：內切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,EC 3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21)。其中內切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結晶區(qū),隨機水解纖維素鏈中的糖苷鍵，產生大量不同聚合度的纖維素短鏈；外切酶(纖維二糖水解酶)可以從纖維素鏈的還原端(CBHⅠ)或非還原端(CBHⅡ)開始持續(xù)水解纖維素寡糖鏈，釋放纖維二糖并由此破壞纖維素的結晶區(qū)；β-葡聚糖苷酶則主要水解纖維二糖和可溶性纖維寡糖，最終將纖維素轉化為可利用的葡萄糖。

然而，由于木質纖維素結構特殊，由此形成的抗生物降解屏障使其轉化效率并不高。因此，探尋一種高效可行的纖維素酶改良方法以提高酶活力，對提升纖維素酶在食品加工、釀造業(yè)、造紙工業(yè)、紡織業(yè)和燃料乙醇煉制等領域的工業(yè)應用價值具有重要意義。

(三)發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種內切葡聚糖苷酶突變體、基因、載體、工程菌及其應用，本發(fā)明利用定點突變的方法對炭疽菌來源的內切葡聚糖苷酶進行改造，獲得酶活性提高的內切葡聚糖苷酶突變體K202R，能夠用于降解纖維素特別是纖維素結晶多糖，降低工業(yè)應用的經濟成本。

本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供一種內切葡聚糖苷酶突變體，所述內切葡聚糖苷酶突變體是將SEQ IDNo.3所示氨基酸序列第202位的賴氨酸(Lys)突變?yōu)榫彼?Arg)；所述突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明SEQ ID NO.3所示氨基酸序列為基因庫中來源于炭疽菌(Colletotrichum graminicola)M1.001的內切葡聚糖苷酶的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供一種內切葡聚糖苷酶突變體的編碼基因，所述編碼基因核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還涉及包含內切葡聚糖苷酶突變體編碼基因的重組載體，以及由重組載體構建的基因工程菌。

本發(fā)明所述重組載體以pPIC9K為質粒，所述工程菌以畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115為宿主細胞。

本發(fā)明還提供一種所述內切葡聚糖苷酶突變體在降解纖維素中的應用。

進一步，所述纖維素包括羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、Whatman No.1濾紙、細菌微晶纖維素(BMCC)或玉米芯；所述玉米芯是將干燥玉米芯廢渣用質量濃度12％KOH水溶液在70℃浸泡12h后，用清水洗滌至pH9以下，冷凍干燥制成。