[發明專利]一種內切葡聚糖苷酶突變體、基因、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202010471544.1
• 申請日: 2020-05-29
• 公開（公告）號: CN111690629B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 柳志強;周海巖;易曉男;周建寶;薛亞平;鄭裕國;陳德水;程新平;李勉;王紅艷;陳凱茜
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江華康藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種內切葡聚糖苷酶突變體，其特征在于所述內切葡聚糖苷酶突變體是將SEQ IDNo.3所示氨基酸序列第202位的賴氨酸突變為精氨酸。

2.一種權利要求1所述內切葡聚糖苷酶突變體的編碼基因，其特征在于所述編碼基因核苷酸序列為SEQ ID No.2所示。

3.一種包含權利要求2所述編碼基因的重組載體。

4.一種包含權利要求3所述重組載體的重組基因工程菌。

5.一種權利要求1所述內切葡聚糖苷酶突變體在降解纖維素中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述纖維素包括羧甲基纖維素鈉、WhatmanNo.1濾紙、細菌微晶纖維素或玉米芯；所述玉米芯是將干燥的玉米芯廢渣用質量濃度12％KOH水溶液在70℃浸泡12h后，用清水洗滌至pH9以下，冷凍干燥制成。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述應用的方法為：以纖維素為底物，以含內切葡聚糖苷酶突變體基因的工程菌經發酵培養后的上清液或上清液提取的純酶為催化劑，在pH3.5-8.0的緩沖液中構成反應體系，在45-90℃、500rpm反應12-96h，向反應液中添加纖維素酶，繼續反應2h，然后煮沸終止反應，離心，取上清液，獲得降解后的纖維素；所述纖維素酶由100mg/mL外切葡聚糖苷酶無菌水溶液與100mg/mLβ-葡萄糖苷酶無菌水溶液以體積比3:1混合而成，其中外切葡聚糖苷酶的酶活為0.13U/mg，β-葡萄糖苷酶的酶活為4U/mg。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述底物加入終濃度為5-30mg/mL，所述催化劑加入量為10-50U/mL，所述纖維素酶加入終濃度為1-10mg/mL。

9.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含內切葡聚糖苷酶突變基因的工程菌接種至YPD培養基，30℃培養24h，然后以體積濃度1％接種量轉接到含體積濃度1％甘油的BMGY培養基，30℃培養16～20h，4000rpm離心10min，棄上清，菌體沉淀重懸于BMMY培養基中，30℃培養，每24h添加甲醇至體積終濃度為1％，誘導5天后，12000rpm離心30min，收集上清液；將上清液用孔徑0.22μm水系膜過濾，用Ni²⁺螯合瓊脂糖樹脂柱進行蛋白純化，分別用含30、50、100、500mM咪唑的pH7.4磷酸緩沖液進行梯度洗脫，收集含100mM咪唑的pH7.4磷酸緩沖液洗脫時的流出液，用10kDa的超濾管過濾后，再用MilliQwater洗滌一次，獲得內切葡聚糖苷酶純酶。