[發(fā)明專利]一種提高AA-2G產(chǎn)量的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010466158.3
• 申請日: 2020-05-28
• 公開（公告）號: CN111560361B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃燕;陶秀梅;王蕾;宿玲恰;吳敬;孔德民
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12P19/60
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種提高AA?2G產(chǎn)量的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過對來源于Bacillus circulans 251的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行改造，得環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Y195F。以廉價(jià)的淀粉或淀粉衍生物為底物，利用突變體Y195F催化生產(chǎn)AA?2G，AA?2G產(chǎn)量可達(dá)29g/L，較野生型提高了52.6％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高AA-2G產(chǎn)量的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素C(VC)是一種人體自身不能合成的水溶性維生素，參與體內(nèi)很多的生理活動(dòng)，如促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的合成，參與芳香氨基酸的代謝，促進(jìn)鐵的吸收及參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，在維持和促進(jìn)人體健康中扮演著重要的角色。另外，維生素C還能促進(jìn)膠原蛋白的合成，還原已形成的黑色素，對保持皮膚彈性、美白、除皺有一定的作用。廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。但是VC二位碳的羥基極不穩(wěn)定，非常容易氧化降解而限制了其應(yīng)用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是一種維生素C的糖類衍生物，是最穩(wěn)定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作為一種美白添加劑應(yīng)用于多種品牌的高端化妝品中。

目前，AA-2G主要通過糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是最常用的催化酶?，F(xiàn)有技術(shù)針對環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因改造和高效表達(dá)研究較多，但是實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在工業(yè)化生產(chǎn)中仍存在很大的問題，如酶催化制備AA-2G的轉(zhuǎn)化率低。CGTase具有以分子間轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)制備特定產(chǎn)物的優(yōu)良應(yīng)用性能，其受體分子具有廣譜性，但針對不同受體，獲得的轉(zhuǎn)化率差異很大，通常以糖類分子作為天然受體分子，其轉(zhuǎn)化率明顯高于非糖類分子，如本研究中的VC，并且以非糖分子做受體的產(chǎn)量以提高。然而，α-環(huán)糊精價(jià)格昂貴，β-環(huán)糊精很難溶于水，所以從生產(chǎn)成本考慮，兩者均不適合大規(guī)模生產(chǎn)AA-2G。因此，以價(jià)廉易得的淀粉或麥芽糊精為糖基供體，通過分子改造CGTase技術(shù)提高VC作為受體的底物特異性，將推動(dòng)L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

針對目前存在的問題，本發(fā)明將來源于Bacillus circulans 251的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行改造，得到了一種能使AA-2G產(chǎn)量提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體。

本發(fā)明提供一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述突變體是以氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為親本，將親本的第195位進(jìn)行突變。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體相對于親本，將親本第195位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?，并將其命名為Y195F。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體Y195F的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明提供一種編碼所述突變體Y195F的基因。

本發(fā)明提供一種攜帶編碼所述突變體酶的基因的重組表達(dá)載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組表達(dá)載體為pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述pET系列載體包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列載體包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1或pCDFDuet-1，所述pGEX系列載體包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。

本發(fā)明提供一種攜帶編碼所述突變體酶的基因的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為重組原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或短小芽孢桿菌。